Flexibilité de la biosynthèse du peptidoglycane de la paroi des bactéries à Gram positif

Le peptidoglycane (PG) est un constituant majeur de la paroi des bactéries à Gram positif. Ce polymère de chaînes de sucres reliées entre elles par des peptides entoure la cellule d'un sacculus protecteur. Structure dynamique, il permet à la bactérie de croître et de se diviser tout en assurant sa survie et le maintien de sa forme. La biosynthèse du PG est initiée dans le cytoplasme par la formation d'un précurseur soluble, qui est transporté à la face externe de la membrane plasmique où il est incorporé au PG par les PBPs ou "penicillin binding protein". Les PBPs collaborent avec des hydrolases du PG, qui permettent l'expansion du sacculus et assurent le remodelage ou "maturation" du polymère. La chaîne peptidique du précurseur du PG de Lactococcus lactis se termine par D-alanyl-D-alanine. Chez Lactobacillus plantarum, elle se termine par D-alanyl-D-lactate, ce qui confère la résistance à la vancomycine, un antibiotique dont la cible est la terminaison D-Ala-D-Ala. Au cours de ce travail, nous avons étudié la flexibilité de la synthèse du PG vis à vis de la nature du dernier résidu du précurseur chez ces deux espèces. La stratégie mise en œuvre consistait à produire des précurseurs se terminant par D-Ala chez L. plantarum et par D-Lac chez L. lactis. Chez L. plantarum, nous avons mis en évidence la présence d'une D-Ala-D-Ala dipeptidase intervenant dans la sélectivité de l'incorporation du D-Lac dans le précurseur. Nos résultats indiquent également que le précurseur se terminant par D-Ala n'est pas un substrat optimal pour la synthèse du PG. Chez L. lactis, la modification du précurseur mène à des altérations importantes de la composition biochimique du PG et de la morphologie. Ceci suggère que le précurseur modifié interfère avec l'activité des PBPs et/ou des hydrolases du PG. Nos résultats démontrent que malgré un certain niveau de flexibilité de la machinerie de synthèse du PG, la nature du précurseur joue un rôle clef dans la biosynthèse du PG et dans la morphogenèse.

The cell wall of Gram-positive bacteria is mainly made of peptidoglycan, a thick, multilayered covalent macropolymer of glycan chains cross-linked via short peptides. The peptidoglycan sacculus is a dynamic structure allowing growth and division, while maintaining cell integrity and shape. Its synthesis starts in the cytoplasm by the formation of a disaccharide-pentapeptide precursor that is subsequently transported through the plasma membrane and incorporated into the nascent peptidoglycan by penicillin binding proteins (PBPs). The two last residues of the pentapeptide chain are linked together by a specific ligase (Ddl) before their incorporation into the precursor as a dipeptide. In many bacterial species, the terminus of peptidoglycan precursor is D-alanyl-D-alanine, which is the target of vancomycin, an important antibiotic that inhibits peptidoglycan synthesis. Vancomycin prevents PBPs activities by binding the precursor once transported to the external face of the plasma membrane. Lactobacillus plantarum produces precursors terminated by D-lactate instead of D-alanine, making the bacterium intrinsically resistant to vancomycin. The Ddl ligase of L. plantarum plays a central role in this specificity by synthesizing D-alanyl-D-lactate depsipetides. In this study, we show that L. plantarum also encodes a specific dipeptidase, Aad, the function of which is to selectively eliminate D-alanyl-D-alanine dipeptides that are produced by the Ddl ligase, thereby preventing their incorporation into the precursors. Although "non canonical" D-alanine-ended precursors can be incorporated in the cell wall, inactivation of Aad failed to suppress growth defects of L. plantarum mutants deficient in D-lactate-ended precursors synthesis, indicating additional levels of control in peptidoglycan precursors selectivity. The importance of the nature of the pentapeptide last residue was also evaluated in Lactococcus lactis, a vancomycin sensitive species, which uses D-alanyl-D-alanine dipeptides for peptidoglycan synthesis. For this, a mutant strain of L. lactis producing D-lactate-ended precursors instead of D-alanine-ended precursors was constructed by expressing genes from L. plantarum. We found that both the Ddl ligase and the Aad dipeptidase were required to confer vancomycin resistance to L. lactis, confirming the role of Aad in D-lactate selectivity. In addition, the modification of the last residue of the peptide moiety of the precursor affected cell wall composition and cell morphology. Mutant cells were spherical instead of ovoid and formed chains not normally observed with the wild-type cells. This suggests that modified precursors interfere with the activity of enzymes involved in peptidoglycan growth and maturation, such as PBPs and /or peptidoglycan hydrolases. Together, these results demonstrate that despite some level of functional flexibility in peptidoglycan biosynthesis machinery, the nature of the precursor plays a key role in cell wall synthesis and morphogenesis.