Évaluation de la stabilité d'un nanobody PEGylé dans le développement d'un traitement pour des maladies pulmonaires muco-obstructives

La mucoviscidose et la dyskinésie ciliaire sont deux pathologies génétiques. La première est liée à une mutation dans le gène CFTR et entraine des problèmes multi-systémiques dont les plus importants sont au niveau des poumons où le mucus est trop visqueux. La dyskinésie ciliaire, elle, affecte les cils qui recouvrent les voies pulmonaires et permettent l’évacuation du mucus de celles-ci. Ces deux pathologies ont en commun qu’une accumulation et une mauvaise évacuation chronique du mucus dans les poumons entraine différents problèmes, comme une colonisation par des pathogènes et une inflammation chronique. Celle-ci entraine un recrutement intense neutrophiles, qui produisent des protéases pour dégrader la matrice extracellulaire pour pouvoir accéder au site d’infection et y détruire les pathogènes, mais dans le cas d’une inflammation chronique, cette activité des protéases devient trop importante et détrimentaire aux tissus pulmonaires. La principale protéase responsable de ces problèmes est l’élastase des neutrophiles. Aussi, un nanobody, un fragment d’anticorps à domaine unique, monomérique et plus simple à produire qu’un anticorps classique, capable d’inhiber complètement l’élastase a été développé. Dans le but d’augmenter son temps de résidence dans les poumons, une molécule de poly-éthylène glycol lui a été ajoutée. Le but de ce travail est d’étudier la stabilité de cette version PEGylée du nanobody contre des protéases et dans des sputa de patients malades en comparaison avec le nanobody WT et l’AAT, l’inhibiteur endogène. Lorsque les NbWT et les NbPEGylés sont exposés pendant 24h, 4h et 1h à la cathepsine G ou la trypsine, la PEGylation semble offrir une protection contre la dégradation. Lorsque les NbWT, les NbPEGylés et l’AAT sont exposés au sputum pendant 24h, 4h, 1h et 0h, le NbWT semble rapidement dégradé, mais les deux autres semblent plus stable. Lorsque l’activité de l’élastase est mesurée dans des sputa de patients après y avoir incubé les NbWT, les NbPEGylés et l’AAT pendant 24h, 4h, 1h et 0h, la capacité d’inhibition des Nb est initialement plus forte mais décroit plus rapidement que celles de l’AAT. Celle des les NbPEGylés décroit plus lentement que celle du WT. Cette différence de comportement de l’AAT pourrait être due à son inactivation par oxydation ou par clivage. Ces résultats montrent que la PEGylation augmente la stabilité du NbE201, ce qui lui permettrait d’être stable plus longtemps dans les poumons des patients, réduisant la fréquence du traitement et son coût. Néanmoins, de nombreux tests doivent encore être faits avant que ce traitement puisse un jour être commercialisé.  Cystic fibrosis and ciliary dyskinesia are two genetic pathologies. The former is linked to a mutation in the CFTR gene and causes multi-systemic problems, the most important of which are in the lungs, where mucus is too viscous. Ciliary dyskinesia, on the other hand, affects the cilia that cover the pulmonary airways and enable mucus to be evacuated from them. What these two conditions have in common is that chronic mucus accumulation and evacuation in the lungs leads to problems such as pathogen colonization and chronic inflammation. The latter leads to intense recruitment of neutrophils, which produce proteases to degrade the extracellular matrix in order to gain access to the site of infection and destroy pathogens, but in the case of chronic inflammation, this protease activity becomes too great and detrimental to lung tissue. The main protease responsible for these problems is neutrophil elastase. This has led to the development of a single-domain antibody fragment that is monomeric and simpler to produce than a conventional antibody, and capable of completely inhibiting elastase. In order to increase its residence time in the lungs, a polyethylene glycol molecule was added. The aim of this work is to study the stability of this PEGylated version of the nanobody against proteases and in sputa from diseased patients, in comparison with nanobody WT and AAT, the endogenous inhibitor. When NbWT and PEGylated Nb were exposed for 24h, 4h and 1h to cathepsin G or trypsin, PEGylation appeared to offer protection against degradation. When NbWT, NbPEGylated and AAT are exposed to sputum for 24h, 4h, 1h and 0h, NbWT appears rapidly degraded, but the other two appear more stable. When elastase activity is measured in patient sputa after incubation with NbWT, NbPEGylated and AAT for 24h, 4h, 1h and 0h, the inhibitory capacity of Nb is initially stronger but decreases more rapidly than that of AAT. The inhibition capacity of NbPEGylated decreases more slowly than that of WT. This difference in AAT behavior could be due to its inactivation by oxidation or cleavage. These results show that PEGylation increases the stability of Nb, enabling it to remain stable for longer in patients' lungs, reducing treatment frequency and cost. Nevertheless, much testing remains to be done before this treatment can one day be commercialized.