Caractérisation fonctionnelle de la bactériocine PsnL chez Streptococcus salivarius

Depuis la découverte de la pénicilline en 1928, de nombreux antibiotiques ont été développés et sont devenus des médicaments couramment utilisés pour traiter les infections bactériennes. Cependant, à cause de l’utilisation excessive et parfois inadéquate de ceux-ci, nous devons maintenant faire face à un nombre croissant d’infections multirésistantes aux antibiotiques. Diverses stratégies alternatives pour combattre ces infections sont étudiées. Parmi celles-ci, l’utilisation de bactériocines, des peptides antimicrobiens produits naturellement par certaines bactéries, semble être une alternative prometteuse. Dans le laboratoire du Pr. Pascal Hols, la bactérie lactique Streptococcus salivarius est étudiée pour sa capacité à produire plusieurs bactériocines. Cette bactérie commensale est retrouvée dans la cavité buccale et l’intestin humain. Récemment, un crible bio-informatique a permis au laboratoire de découvrir une nouvelle bactériocine de la classe IId chez S. salivarius, nommée PsnL. PsnL montre une activité contre des espèces pathogènes d’importance prioritaire, telles que Staphylococcus aureus et Enterococcus faecium, pour lesquelles les antibiotiques actuels ne seront bientôt plus efficaces. Cette bactériocine agit en ciblant la membrane bactérienne, probablement en y induisant des pores qui mèneraient à la perte du contenu cellulaire, mécanisme commun chez les bactériocines agissant sur la membrane. L’objectif principal de ce mémoire était la caractérisation structurelle et fonctionnelle de la bactériocine PsnL chez S. salivarius. Pour se faire, un crible par mutagenèse en alanine a été réalisé afin de déterminer les acides aminés essentiels au fonctionnement de PsnL. L’activité des mutants a été évaluée par un test semi-quantitatif de production de bactériocines contre différentes souches indicatrices. Des mutations rationnelles ont ensuite été générées pour approfondir nos résultats. Pour finir, ces résultats ont été confrontés à des modèles 3D de PsnL pour permettre des interprétations rationnelles. Cinq classes de résidus déterminants pour l’activité de la bactériocine ont été identifiées: les cystéines, les glycines, les résidus polaires, les résidus chargés et les résidus aromatiques. Ces résidus interviendraient dans la reconnaissance du récepteur, l’oligomérisation et la formation de pores par PsnL. Un modèle d’oligomère à trois peptides PsnL a été proposé afin d’expliquer au mieux nos résultats. Nous émettons l’hypothèse que ce trimère pourrait être une conformation intermédiaire favorisant la solubilité du peptide en solution. En interaction avec la membrane, cette conformation pourrait alors changer pour former un oligomère de plus grande taille capable de former un pore. Néanmoins, des recherches supplémentaires seront nécessaires pour supporter cette hypothèse. Cette étude a donc permis une caractérisation primaire de la bactériocine PsnL produite par S. salivarius. Cette approche pourrait être appliquée à d’autres bactériocines de la classe IId, améliorant notre compréhension sur leurs mécanismes d’action. Une telle caractérisation pourrait faciliter de futures recherches visant à optimiser PsnL pour des applications dans le secteur médical et/ou agroalimentaire. De plus, la souche productrice de bactériocines pourrait également être utilisée comme probiotique. Since the discovery of penicillin in 1928, many antibiotics have been developed and have become commonly used drugs to treat bacterial infections. Antibiotic resistance is becoming more common due to the overuse and misuse of antibiotics. As a result, we are now experiencing a rise in the number of infections that are resistant to multiple antibiotics. Various alternative strategies to treat these infections are being investigated. Among these, the use of bacteriocins, antimicrobial peptides produced naturally by some bacteria, is considered as a promising route. In Prof. Pascal Hols' laboratory, the lactic acid bacterium Streptococcus salivarius is studied for its ability to produce several bacteriocins. This commensal bacterium is found in the human oral cavity and the small intestine. Recently, a bioinformatics screen allowed the laboratory to discover a new class IId bacteriocin in S. salivarius, named PsnL. PsnL shows activity against priority pathogenic species, such as Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium, for which current antibiotics will soon no longer be effective. This bacteriocin acts by targeting the bacterial membrane, presumably by inducing pores that would lead to the loss of cell content, a common mechanism for membrane-acting bacteriocins. The main objective of this master thesis was the structural and functional characterization of the bacteriocin PsnL in S. salivarius. Therefore, an alanine mutagenesis screen was performed to identify essential amino acids for PsnL function. The activity of the mutants was assessed by a semi-quantitative bacteriocin production test against different indicator strains. Rational mutations were then generated to further investigate our results. Finally, the results were compared with 3D models of PsnL to allow rational interpretations. Five classes of residues were identified as critical for bacteriocin activity: cysteines, glycines, polar residues, charged residues and aromatic residues. These residues are thought to be involved in receptor recognition, oligomerization, and pore formation by PsnL. A three-peptide PsnL oligomer model has been proposed to explain our results. We hypothesize that this trimer could be an intermediate conformation favoring the solubility of the peptide in solution. Upon interaction with the membrane, this conformation could change to form a larger oligomer capable of forming a pore. However, further research will be needed to support this hypothesis. Therefore, this study allowed a primary characterization of the PsnL bacteriocin produced by S. salivarius. This investigation could be applicable to other class IId bacteriocins, improving our understanding of their mechanisms of action. Such characterization could facilitate future research aimed at optimizing PsnL for applications in the medical and/or agro-food sector. In addition, the bacteriocin-producing strain could also be used as a probiotic.