Etude in vitro et in vivo des homologues de AgrE chez Enterocloster asparagiformis et Aerococcus urinae

Les COG1915 sont suspectés d’être des Ornithine cyclodéaminase (OCD) dépendantes du cofacteur NPN. La base de données “Cluster of orthologous group” (COG), regroupe les protéines orthologues à partir de génomes complets. Les OCDs catalysent la conversion d’ornithine en proline. Les protéines EaCOG1915 (COG1915 présentes chez Enterocloster asparagiformis) ont été purifiées à partir de souches Escherichia coli. Les tests d’activité n’ont révélé aucune activité OCD dépendante du NPN. Ce test d’activité a été réalisé à l’aide d’une électrophorèse capillaire. Un deuxième test d’activité a été réalisé sur les EaCOG1915 à l’aide de protéines produites dans une souche synthétisant également le NPN. Nous ne sommes jamais parvenus à purifier ces protéines dans cette souche et aucun test d’activité n’a pu être réalisé. Lors de ce mémoire nous avons également recherché une activité OCD in vivo. Lors de ces tests, nous mettons en culture les bactéries dans des milieux auxotrophes pour révéler la présence de voies métaboliques. C’est la modification du milieu et la capacité de croissance de la culture qui permettent d’indiquer les voies métaboliques présentes in vivo chez les bactéries étudiées. Deux espèces ont été utilisées lors de ces tests : Enterocloster asparagiformis et Aerococcus urinae. Chez E. asparagiformis, nous avions pour projet de comparer la composition du milieu de culture avant et après culture de la bactérie. La croissance de la bactérie dans ce milieu aurait impliqué l’apparition ou la disparition de molécules et ainsi révélé une voie métabolique impliquant une OCD. Par la suite, nous aurions recherché les gènes responsables de cette activité OCD. La délétion de gènes EaCOG1915 aurait permis d’apporter la preuve que les EaCOG1915 sont responsables de l’OCD. Nous ne sommes pas parvenus durant ce mémoire à regrouper les conditions nécessaires à la délétion de gènes dans une bactérie E. asparagiformis. Nous ne considérons pas que l’utilisation de cette espèce pour notre expérience soit judicieuse. Pour la suite des expériences, nous avons donc privilégié une autre espèce : A. urinae. Chez A. urinae, nous avions pour projet de prouver que les COG1915 sont impliqués dans une voie métabolique permettant la synthèse d’arginine et que cette activité était dépendante du cofacteur NPN. Nous nous sommes rendu compte par après que cette hypothèse était fausse. Ce test in vivo se base sur le principe de croissance en milieu auxotrophe. La croissance de la bactérie dans ce milieu aurait révélé une voie métabolique impliquant une OCD. Aerococcus ne sait pas croître sans arginine et la production de cet acide aminé est révélé par son absence dans le milieu de culture. La synthèse du cofacteur NPN nécessite de l’acide nicotinique et l’implication du cofacteur est révélé par l’absence de l’acide nicotinique. Nous sommes parvenus à cultiver A. urinae dans les laboratoires grâce à un CDM de S. salivarius et l’ajout de catalase. Lors des tests in vivo aucune tendance générale n’a été observée et les tests d’activité n’ont pas permis de révéler si A. urinae est capable de produire de l’arginine. Selon notre hypothèse, dans un milieu sans arginine, A. urinae aurait été davantage capable de croître en présence d’acide nicotinique que sans acide nicotinique. Pourtant, dans chaque condition A. urinae a fourni une faible croissance. Il peut être fait une autre hypothèse : l’OCD participe au catabolisme de l’arginine via la citrulline. COG1915 is suspected to be NPN cofactor Ornithine cyclodeaminase dependent (OCD). The "Cluster of orthologous group" (COG) database, groups orthologous proteins from complete genomes. OCDs catalyze the conversion of ornithine to proline. The EaCOG1915 proteins (COG1915 present in Enterocloster asparagiformis) were purified from Escherichia coli strains. The activity tests did not reveal any NPN-dependent OCD activity. This activity test was performed using capillary electrophoresis. A second activity assay was performed on EaCOG1915 using proteins produced in a strain that also synthesizes NPN. We never managed to purify these proteins in this strain and no activity test could be performed. In this thesis we also looked for OCD activity in vivo. In these tests, we cultured the bacteria in auxotrophic media to reveal the presence of metabolic pathways. It is the modification of the medium and the growth capacity of the culture that indicate the metabolic pathways present in vivo in the bacteria studied. Two species were used in these tests: Enterocloster asparagiformis and Aerococcus urinae. In E. asparagiformis, we planned to compare the composition of the culture medium before and after cultivation of the bacteria. The growth of the bacterium in this medium would have involved the appearance or disappearance of molecules and thus reveal a metabolic pathway involving an OCD. Subsequently, we would have looked for the genes responsible for this OCD activity. The deletion of EaCOG1915 genes would have provided evidence that EaCOG1915 are responsible for OCD. During this dissertation we have not been able to bring together the necessary conditions for gene deletion in an E. asparagiformis bacterium. We do not consider that the use of this species for our experiment is judicious. For the rest of the experiments, we have therefore chosen another species: A. urinae. In A. urinae, our project was to prove that COG1915 are involved in a metabolic pathway allowing arginine synthesis and that this activity was dependent on the NPN cofactor. We later realized that this hypothesis was wrong. This in vivo test is based on the principle of growth in an auxotrophic environment. The growth of the bacterium in this medium would have revealed a metabolic pathway involving OCD. Aerococcus cannot grow without arginine and the production of this amino acid is revealed by its absence in the culture medium. The synthesis of the NPN cofactor requires nicotinic acid and the involvement of the cofactor is revealed by the absence of nicotinic acid. We were able to grow A. urinae in the laboratory using S. salivarius CDM and the addition of catalase. In vivo tests no general trend was observed and activity tests did not reveal whether A. urinae is able to produce arginine. Our hypothesis is that in a medium without arginine, A. urinae would have been more able to grow in the presence of nicotinic acid than without nicotinic acid. However, in each condition A. urinae provided poor growth. An alternative hypothesis is that OCD participates in the catabolism of arginine via citrulline.