Utilisation de la conjugaison bactérienne, associée à Crispr/Cas9 pour combattre les bactéries multi-résistantes

Le problème lié aux bactéries multi-résistantes aux antibiotiques devient une urgence à l’échelle mondiale. La découverte de nouveaux antibiotiques se faisant de plus en plus rare, nous risquons de revenir à une époque pré-antibiotique, où la moindre infection bactérienne risquerait d’être fatale pour la santé. Les bactéries acquièrent des résistance aux antibiotiques par mutation, ou par échange de matériel génétique. En effet, lorsqu’une bactérie possède déjà un gène de résistance à un antibiotique, elle peut le transmettre à d’autres bactéries par un mécanisme de transfert horizontal de gènes : la conjugaison. La conjugaison bactérienne consiste en un transfert de matériel génétique – principalement de plasmides - entre deux bactéries en contact. Les bactéries contenant les gènes nécessaires à la conjugaison mettent en place la machinerie nécessaire pour établir le contact entre les deux bactéries, et initient la coupure simple brin du plasmide conjugatif qui est alors « tracté » vers la bactérie receveuse par un système de sécrétion spécifique. Une fois transféré, le plasmide est alors re-synthétisé sous forme double brin et la bactérie cible devient porteuse du même plasmide que la bactérie donneuse. Le projet de ce mémoire consiste à tirer profit du mécanisme de conjugaison, pour aller détruire les gènes bactériens de résistance aux antibiotiques. En effet, l’idée est d’utiliser une bactérie « donneuse » portant un plasmide de conjugaison, lui-même équipé d’un système « tueur » basé sur Crispr/Cas9 afin de cibler et détruire un gène de résistance aux antibiotiques chez une bactérie cible « receveuse ». Dans un premier temps nous avons assemblé le gène de la protéine Cas9 avec un guide RNA (sgRNA) ciblant le gène de résistance à l’ampicilline ou le gène de la RFP. Nous avons ensuite inséré ce fragment, avec un marqueur de sélection, dans le plasmide mobilisable pK18mob. Une fois ce plasmide créé, nous l’avons transformé dans une souche « donneuse » E.coli MFDPir contenant la machinerie de conjugaison RP4 dans son chromosome. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé plusieurs expériences de conjugaison vers des souches receveuses E.coli portant un plasmide résistant à l’ampicilline ou portant le gène de la RFP. Nous avons montré que notre plasmide mobilisable Crispr/Cas9 était à la fois capable de conjuguer vers ces souches receveuses, et de couper le gène cible. En effet, nous avons observé une fréquence de conjugaison de l’ordre de 10-4, et vu que le système Crispr/Cas9 avait une efficacité proche de 100 %. Nous avons également pu vérifier que ce système était également efficace lorsque le gène cible était présent dans le chromosome. Comme attendu, notre bactérie donneuse contrôle, portant le plasmide mobilisable avec le gène Cas9 mais sans guide RNA, n’a pas été capable de couper le gène cible. Cependant, nous n'avons pas pu observer de conjugaisons inter-espèces de notre plasmide mobilisable vers des souches telles que Pseudomonas putida et Klebsiella pneumoniae, alors que la conjugaison du plasmide autonome RP4 est efficace à plus de 50% avec ces souches. Il serait intéressant dans le futur d’utiliser ce système Crispr/Cas9 dans un plasmide de conjugaison autonome afin de rendre le système de dissémination beaucoup plus efficace. A terme, ce système pourrait compléter les différentes solutions qui sont mises en place pour lutter contre la multi-résistance bactérienne.