Utilisation de la conjugaison bactérienne, associée à Crispr/Cas9 pour combattre les bactéries multi-résistantes

Le problème lié aux bactéries multi-résistantes aux antibiotiques devient une urgence à l’échelle mondiale. En effet, l’OMS estime que d’ici 2050, il y aura plus de décès dans le monde dus à ces bactéries pathogènes que de décès liés aux cancers. La mauvaise utilisation des antibiotiques depuis de nombreuses années a permis, entre autres, l’apparition et le développement de bactéries multi-résistantes. La découverte de nouveaux antibiotiques se faisant de plus en plus rare, nous risquons de revenir à une époque pré-antibiotique, où la moindre infection bactérienne risquait d’être fatale pour la santé. Les causes de l’apparition de la multi-résistance aux antibiotiques sont multiples. Elles sont principalement dues à la surutilisation d’antibiotiques dans la médecine moderne et dans le secteur agroalimentaire. Cela entraîne une évolution des bactéries qui, par mutation ou échange d’ADN, acquièrent des gènes de résistance à ces antibiotiques. Ces bactéries résistantes se multiplient et deviennent alors majoritaires, rendant la lutte contre l’infection très difficile. Pour aggraver la situation, lorsqu’une bactérie possède un gène de résistance à un antibiotique, elle peut le transmettre à d’autres bactéries de la même espèce ou d’espèces différentes. Ce mode de transmission « horizontal » est principalement dû à la transformation naturelle, à la transduction via bactériophages, ou encore à la conjugaison entre bactéries. La conjugaison bactérienne, un des phénomènes naturels moteurs de l’évolution bactérienne, consiste en un transfert d’ADN – principalement de plasmides - entre deux bactéries en contact. Les bactéries contenant les gènes nécessaires à la conjugaison mettent en place la machinerie nécessaire pour établir le contact entre les deux bactéries, et initient la coupure simple brin du plasmide conjugatif qui est alors « tracté » vers la bactérie receveuse par un système de sécrétion spécifique. Une fois transféré, le plasmide est alors re-synthétisé sous forme double brin et la bactérie cible devient porteuse du même plasmide que la bactérie donneuse. Au final, ce système permet un échange de matériel génétique entre bactéries, tel que par exemple des gènes de résistance aux antibiotiques. Le projet de ce mémoire consiste à tirer profit du mécanisme de conjugaison, pour aller détruire les gènes bactériens de résistance aux antibiotiques. En effet, l’idée est d’utiliser une bactérie « donneuse » portant un plasmide de conjugaison, lui-même équipé d’un système « tueur » basé sur Crispr/Cas9 afin de cibler et détruire un gène de résistance aux antibiotiques chez une bactérie cible « receveuse ». Dans un premier temps, nous allons utiliser le système Crispr/Cas9 dans un plasmide de conjugaison minimum de type « mobilisable », c’est-à-dire un plasmide relativement petit, dont l’essentiel de la machinerie de conjugaison est fournie par le génome de la bactérie hôte. Dans un deuxième temps, l’idée sera d’utiliser le système Crispr/Cas9 dans un plasmide de conjugaison autonome afin de rendre le système de dissémination beaucoup plus efficace. Notre système a montré le bon fonctionnement de Crispr/Cas9 avec un plasmide de type mobilisable et a permis de couper un gène de résistance à l’ampicilline présent, soit dans un plasmide, soit dans le chromosome. La mise en place de ce système dans le plasmide autonome RP4 est prometteuse mais nécessite des développements ultérieurs. A terme, ce système pourrait compléter les différentes solutions qui sont mises en place pour lutter contre la multi- résistance bactérienne. The problem of multidrug-resistant bacteria is becoming a global emergency. Indeed, the WHO estimates that by 2050, there will be more deaths in the world due to these pathogenic bacteria than cancer-related deaths. The misuse of antibiotics for many years has led, among other things, to the appearance and development of multi-resistant bacteria. With the discovery of new antibiotics becoming increasingly rare, we risk returning to a pre-antibiotic era, where the slightest bacterial infection can be very dangerous to health. The causes of the emergence of multi-resistance to antibiotics are multiple. They are mainly due to the overuse of antibiotics in modern medicine and in the food industry. This leads to an evolution of bacteria which, through mutation or DNA exchange, promotes the acquisition of genes conferring resistance to these antibiotics. Resistant bacteria then multiply and then become the majority, making the fight against infection very difficult. To make matters worse, when a bacterium has a gene for resistance to an antibiotic, it can transmit it to other bacteria of the same species or to different genera. This "horizontal" mode of transmission is mainly due to natural transformation, transduction via bacteriophages, or conjugation between bacteria. Bacterial conjugation, one of the natural phenomena driving evolution, consists of a transfer of DNA - mainly via plasmids - between two bacteria in contact. Bacteria containing the genes necessary for conjugation initiate the machinery necessary for the formation of a pilus to establish contacts between the two bacteria, initiates the single-stranded cut of the conjugative plasmid which is then "pulled" to the recipient cell by a specialized secretion system. Once transferred, the plasmid is then synthesized as a double-stranded plasmid and the target bacterium then carries the same plasmid as the donor bacterium. In the end, this system allows an exchange of genetic material between bacteria, such as an antibiotic resistance genes. The project related to this thesis consists in taking advantage of the conjugation mechanism to destroy bacterial antibiotic resistance genes. Indeed, the idea is to use a "donor" bacterium carrying a conjugation plasmid, itself containing a DNA “killing” system based on Crispr/Cas9 to target and destroy an antibiotic resistance gene in a target "recipient" bacterium. In a first step, we will use the Crispr/Cas9 system in a minimum "mobilizable" type conjugation plasmid, i.e. a relatively small plasmid, the bulk of the conjugation machinery of which is contained in the genome of the host bacterium. In a second step, the idea will be to use the Crispr/Cas9 system in an autonomous conjugation plasmid in order to make the dissemination system much more efficient. Our system has shown that Crispr/Cas9 works well with a mobilizable plasmid and has made it possible to cut an ampicillin resistance gene present either in a plasmid or in the chromosome of a recipient cell. The implementation of this system in a stand-alone plasmid is promising and, but still at an early stages. This system could perhaps, in the long term, complement the various solutions that are being put in place to combat bacterial multi-resistance.