Caractérisation de la différenciation alternative de kératinocytes humains induite par des expositions répétées aux UVB et étude fonctionnelle de TRIM29, une protéine impliquée dans la survie cellulaire

(eng) Exposures to ultaviolet radiations (UV) is one of the most dangerous stresses to which human skin is exposed daily. Keratinocytes, the main cell type of the epidermis, constitue our first line of defense against UV. UVB are highly mutagenic and are the most deleterious component of sunlight reaching earth surface. We developed an original model of eight repeated sublethal exposures of human keratinocytes lacking p16INK-4a and expressing human telomerase (hTERT), while retaining other growth controls and the ability to fully differentiate in vitro in a reconstructed epidermis. While premature senescence can occur in primary keratinocytes after exposure to a single dose of UVB, we did not observe any significant increase of the proportion of senescence-associated beta-galactosidase activity positive cells following UVB exposure in this cell line in contrast to primary keratinocytes. This suggested a role for p16INK-4a in UVB-induced senescence. We detected severe oxidative stress, sustained DNA damage, prolonged cell cycle arrest, and induction of markers of epidermal differentiation suggesting an alternative differentiation. In vivo, keratinocyte differentiation is an important mechanism of defense against UVB. In order to characterize this phenotype, a proteomic profiling with fluorescent twodimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE) at 16, 40 and 64 h after repeated exposures to UVB allowed to identify 69 differentially abundant protein species. Among these protein species, Capping-protein Gelsolin-like protein (CapG), TRIparite Motif Protein 29 (TRIM29) and several phosphorylated cytokeratins had never been previously involved in the response of keratinocytes to UVB. Increased abundance of capping-protein Gelsolin-like protein was mostly localized on cell edges suggesting its participation in morphological changes through modulation of the actin cytoskeleton. Keratin 8 was phosphorylated on two sites as previously analysed in association with stress. Invalidation of TRIM29 in keratinocytes favored apoptosis after UVB exposure and also in reconstructed epidermis, suggesting a role in a cell survival pathway. Analysis with chemical inhibitors suggested that the increased abundance of TRIM29 was a PKC-dependent process. This work allows a better understanding of specific mechanisms of the defense of keratinocytes repeatedly exposed to UVB particularly through an alternative differentiation process. Furthermore, we revealed that TRIM29 is involved in the cell survival of keratinocytes exposed to UVB.

(fre) L'exposition aux rayonnements ultraviolets (UV) constitue un des stress quotidiens les plus importants auxquels est confrontée la peau. Les kératinocytes, type cellulaire majoritaire de l'épiderme, constituent donc notre première ligne de défense contre les UV. Les UVB sont de puissants mutagènes et sont considérés comme les rayonnements du spectre solaire les plus dangereux. La première partie de ce travail visait à étudier la réponse de kératinocytes humains exposés de façon répétée aux UVB. Un modèle original basé sur huit expositions à une dose sublétale d'UVB a été mis au point sur une lignée de kératinocytes humains. Ces kératinocytes (NhTERT) sont immortalisés par l'expression ectopique de la sous-unité catalytique de la télomérase et n'expriment pas la protéine p16INK4a, un inhibiteur du cycle cellulaire. Ces kératinocytes conservent néanmoins le contrôle du cycle cellulaire et sont capables de se différencier normalement in vitro. L'exposition de façon répétée aux UVB de ces kératinocytes provoque un stress oxydatif sévère et des dommages persistants à l'ADN, menant à un arrêt du cycle cellulaire, et un étalement morphologique. Après exposition aux UVB, les kératinocytes N-hTERT ne possèdent pas d'activité beta-galactosidase associée à la sénescence alors que cette activité est détectée chez les kératinocytes normaux, suggérant que la protéine p16INK4a joue un rôle essentiel dans la sénescence induite prématurément par les UVB. Par contre, plusieurs marqueurs de la différenciation des kératinocytes sont induits après les expositions des cellules N-hTERT, suggérant plutôt un phénotype de différenciation alternative. In vivo, la différenciation est un mécanisme majeur de défense des kératinocytes exposés aux UVB. Nous avons ensuite caractérisé ce modèle par une étude protéomique à l'aide de la technique du 2D-DIGE. Nous avons mis en évidence 69 protéines dont l'abondance varie suite aux expositions aux UVB à 16, 40 et 64 h après la dernière exposition. Parmi ces protéines, CapG (Capping-protein Gelsolin-like protein), TRIM29 (TRIparite Motif Protein 29) et la kératine 8 n'avaient jamais été impliquées dans la réponse des kératinocytes exposés aux UVB. CapG, une protéine de la famille des gelsolines, est localisée à la périphérie cellulaire chez les cellules exposées aux UVB suggérant un rôle dans la morphologie étalée par modification du cytosquelette d'actine. La kératine 8 est phosphorylée sur deux sites associés à un état de stress. Enfin, nous avons étudié l'effet de l'invalidation de la protéine TRIM29 sur les kératinocytes N-hTERT exposés aux UVB. Nous avons montré que TRIM29 joue un rôle important dans la survie des kératinocytes exposés aux UVB, et cela également sur des épidermes reconstitués exposés aux UVB. En parallèle, nous avons tenté de déterminer, à l'aide d'inhibiteurs chimiques, quelle voie de signalisation était impliquée dans l'induction de TRIM29 suite aux expositions aux UVB. Il semble que l'augmentation d'abondance de TRIM29 suite aux expositions aux UVB soit dépendante de la voie des protéines kinases C. Ce travail a permis de mieux comprendre les mécanismes de défense spécifiques des kératinocytes exposés aux UVB les menant à une différentiation alternative. De plus, nous avons mis en évidence la protéine TRIM29 qui favorise la survie des kératinocytes exposés aux UVB.