Vaccination with MAGE-3 peptide and protein induces CD4 T cell responses in some cancer patients

CD4 T cells are implicated in different phases of anti-tumor immune responses, as it was shown in animal models, but for a long time little attention has been given to CD4 T cells in the area of human tumor immunology. We have first participated in the identification of new antigenic peptides encoded by MAGE genes. We have identified a new antigenic peptide encoded by MAGE-4 and presented to CD8 CTL by HLA-B37 molecules. These results are reported in a manuscript included in appendix 1. We identified also an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented to CD4 T cells by HLA-DR1 molecules. Considering that MAGE-3 is expressed in 74% of metastatic melanoma and in 50% of several carcinomas and that HLA-DR1 molecules are expressed in 18% of Caucasians, this antigen could be an interesting target for therapeutic anti-tumoral vaccination. A few clinical trials have been initiated with therapeutic cancer vaccines containing class II-presented peptides or full length proteins. Tumor regressions have been observed in a minority of patients. Considering that anti-tumor T cell responses do not appear to be massive, we have undertaken a systematic effort to develop reproducible monitoring approaches with high specificity and sensitivity. To screen the blood cells of patients vaccinated with a MAGE-3 peptide presented by HLA-DP4, we have constructed and validated an HLA-DP4 fluorescent multimer. Blood cells were labeled ex vivo with a DP4/MAGE-3 multimer and the multimer-positive CD4 T cells were sorted by flow cytometry, cloned, and further tested for their specific recognition of MAGE-3. Using this procedure, a detailed analysis of one patient showed a 3,000-fold increase of the anti-MAGE-3.DP4 CD4 T cell frequency found before immunization and the response was polyclonal. For the patients vaccinated with a protein, we propose an approach to detect the complete set of T lymphocytes that recognize the vaccine-derived peptides on various HLA molecules. Frequencies as low as one specific T cell per million can be measured with frozen samples corresponding to less than 50 ml of blood. Using this approach, we analyzed the frequencies of anti-vaccine CD4 T cells in five metastatic melanoma patients, who have been injected with a MAGE-3 protein without adjuvant and showed tumor regressions. Our approach combines sorting by flow cytometry of living blood T cells producing IFN-gamma after an overnight stimulation with autologous dendritic cells loaded with protein, and detailed specificity assays of the cells amplified in clonal conditions. Anti-MAGE-3 CD4 T cells were detected in one out of the five patients. The frequency was estimated at 1/60,000 of the CD4 T cells in post-vaccination blood samples, representing at least an 80-fold increase of the frequency found before immunization. The 13 anti-MAGE-3 clones, which corresponded to five different TCR clonotypes, recognized the same peptide presented by HLA-DR1, suggesting that this MAGE-3.DR1 peptide is an immunodominant antigen. We also demonstrate that the protein vaccine contains immunogenic contaminants and that the anti-contaminants T cells would have been considered as anti-MAGE-3 specific in routine assays based on cytokine secretion. These tools can now be used to establish whether there is a correlation between the tumoral regressions and the T cell responses against the vaccine antigen and to compare different vaccine modalities.

Les lymphocytes T CD4 sont impliqués dans différentes phases d'une réponse immunitaire anti-tumorale. Pendant longtemps, les immunologistes s'occupant de tumeurs humaines ont accordé peu d'attention aux lymphocytes T CD4, malgré les données obtenues dans des modèles animaux. Notre travail a d'abord consisté en l'identification de nouveaux peptides antigéniques codés par des gènes MAGE. Nous avons identifié un peptide de MAGE-4 présenté à des lymphocytes T cytolytiques CD8 par les molécules HLA-B37. Ces résultats font l'objet d'une publication reprise dans l'annexe 1. Nous avons également identifié un peptide antigénique de MAGE-3 présenté à des lymphocytes T CD4 par des molécules HLA-DR1. Si nous prenons en compte le fait que MAGE-3 est exprimé par 74 % des mélanomes métastatiques et par 50 % des carcinomes de diverses origines, et que les molécules HLA-DR1 sont exprimées par 18 % des Caucasiens, ce nouvel antigène pourrait être une cible intéressante pour une vaccination thérapeutique anti-tumorale. Des essais cliniques de patients cancéreux ont été initiés en utilisant des vaccins thérapeutiques basés sur l'utilisation de peptides présentés par des molécules HLA de classe II et de protéines entières. Des données obtenues avec des lymphocytes T CD8 indiquent que les réponses immunitaires anti-tumorales sont généralement faibles. En conséquence, nous avons entrepris un effort systématique de mise au point de méthodes reproductibles du suivi de la réponse immunitaire anti-vaccinale qui combinent spécificité et sensibilité. Afin de détecter des lymphocytes T spécifiques du peptide MAGE-3.DP4 chez des patients injectés avec ce peptide, nous avons construit et validé le premier multimère fluorescent constitué de molécules HLA-DP. Des cellules du sang ont été incubées avec le multimère directement après décongélation. Les cellules marquées par le multimère ont été triées par cytométrie en flux et clonées afin de pouvoir tester les clones pour leur capacité à reconnaître spécifiquement un antigène de MAGE-3. Cette procédure nous a permis de mettre en évidence après vaccination une augmentation de la fréquence des CD4 anti-MAGE-3.DP4 de 3000 fois. Cette réponse était polyclonale. Pour les patients cancéreux vaccinés avec une protéine entière, nous proposons une approche permettant de détecter les lymphocytes anti-vaccinaux quels que soient le peptide et la molécule HLA qui le présentent. Des fréquences aussi faibles qu'une cellule spécifique par million de CD4 peuvent être mesurées avec un échantillon congelé correspondant à moins de 50 ml de sang. Cette approche nous a permis d'analyser la fréquence des CD4 anti-vaccins chez cinq patients atteints de mélanome métastatique, chez qui des métastases avaient régressé après vaccination avec une protéine MAGE-3 sans adjuvant. L'approche en question combine un tri par cytométrie en flux de cellules vivantes produisant de l'IFN-gamma après une nuit de stimulation avec des cellules dendritiques autologues chargées avec la protéine MAGE-3, et une analyse détaillée de la spécificité anti-MAGE-3 des cellules amplifiées en conditions clonales. Des CD4 anti-MAGE-3 ont été détectées chez l'un des cinq patients. La fréquence dans les échantillons prélevés après vaccination a été estimée à 1/60,000 des CD4, ce qui représente une augmentation de fréquence de plus de 80 x. Les 13 clones anti-MAGE-3 correspondent à cinq clonotypes différents, mais ils reconnaissent tous le même peptide de MAGE-3 présenté par HLA-DR1, suggérant que cet antigène est immuno-dominant. Nous avons aussi démontré que le vaccin protéique contient des contaminants immunogènes et que les lymphocytes qui reconnaissent ces contaminants auraient été considérés comme spécifiques de MAGE-3 dans des essais de routine basés sur la sécrétion de cytokines. Les outils développés lors de ce travail peuvent maintenant être utilisés pour établir une corrélation éventuelle entre des régressions tumorales et des réponses CD4 anti-vaccin et, également, pour comparer différentes modalités de vaccination quant à leur efficacité à induire une réponse immunitaire.