Adenylosuccinate lyase deficiency : study of mutations and pathophysiologic mechanisms

L’adénylosuccinante lyase (ADSL) est une enzyme qui intervient deux fois dans la synthèse des nucléotides puriques : une première fois pour scinder le succinylaminoimidazole carboxamide ribotide (SAICAR) en aminoimidazole carboxamide ribotide (AICAR) et fumarate ; une seconde fois pour scinder l’adénylosuccinate (S-AMP) en AMP et fumarate. Sa déficience se caractérise par l’accumulation, dans le liquide céphalo-rachidien et les urines, des produits de déphosphorylation des deux substrats de l’enzyme, le SAICARriboside et le succinyl-adénosone (S-Ado). Les enfants atteints de cette déficience présentent essentiellement une atteinte neurologique de sévérité variable.
Vu cette importante variabilité, la première partie de mon travail visait à établir des corrélations génotype-phénotype. Pour ce faire, l’ADSL a été exprimée dans un modèle bactérien et les caractéristiques cinétiques des enzymes normales et mutées ont été étudiées. Il en ressort que les protéines mutées peuvent être subdivisées en deux groupes selon leur thermostabilité. D’une part, des mutations thermolabiles qui diminuent l’activité ADSL en parallèle avec les deux substrats, S-AMP et SAICAR. Les patients homozygotes pour ces mutations ont des rapports S-Ado/ SAICARriboside ~ 1 et sont profondément arriérés. D’autre part, des mutations thermostables qui, quant à elles, diminuent beaucoup plus l’activité avec le S-AMP qu’avec le SAICAR. Les patients homozygotes pour ces mutations ont des rapports S-Ado/SAICARriboside ~ 4 et sont beaucoup moins arriérés. Ces résultats suggèrent que la lésion génétique de l’ADSL détermine le rapport des activité S-AMP/SAICAR, qui à son tour détermine le rapport S-Ado- SAICARriboside et l’état mental des patients.
La seconde partie de mon travail avait pour objectif d’élucider les mécanismes physiopathologiques à la base de cette maladie neurologiques. Deux hypothèses ont été principalement étudiées. La première est dérivée de l’observation d’une corrélation entre le rapport des succinylpurines et la gravité des symptômes cliniques et postule un effet neurotoxique du SAICARriboside qui serait contrecarré par la S-Ado. Dans ce cadre, trois approches ont été investiguées, à savoir (1) un effet des succinylpurines sur le récepteur ionotropique du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA), (2) une inhibition de l’hydrolyse de N-acétyl-aspartate (NAA), ce qui occasionnerait une accumulation de ce composé comme dans la maladie de Canavan, et (3) un effet des succinylpurines durant le développement neuronal. Ce travail a permis d’exclure les deux premières possibilités et laisse entrevoir une toxicité des succinylpurines sur des neurones non-différentiés, mais ce point doit être encore poursuivi.
La seconde hypothèse postule la possibilité d’une carence des métabolites qui sont normalement formés en aval de l’ADSL, c’est-à-dire des nucléotides puriques et particulièrement ceux de l’adénine. Pour ce faire, j’ai mesuré la concentration des nucléotides puriques dans le seul modèle de cellules déficientes dont nous disposons, à savoir des fibroblastes de patients. Ce modèle n’est cependant pas optimal car la déficience n’y est que partielle. Pour tenter de rendre ces cellules plus dépendantes de leur synthèse de novo, elles ont été cultivées dans un milieu dépourvu de bases utilisées par la voie de récupération. Cependant, même dans ces conditions, aucune modification de la concentration des pruines n’a pu être mise en évidence.
Cette étude n’a pas permis d’élucider le mécanisme à la base de la déficience mentale chez ces enfants, qui reste mystérieux comme dans de nombreuses maladies métaboliques. Néanmoins, comme décrit dans la dernière partie, il propose un nouveau concept concernant la déphosphorylation des substrats de l’ADSL

Adenylosuccinate lyase (also termed adenylosuccinase, ADSL) catalyses two distinct reactions in purine nucleotide synthesis, and hence its deficiency is characterised by the accumulation in body fluids of SAICAriboside and succinyladenosine (S-Ado), the dephosphorylated derivatives of the two substrates of the enzyme SAICAR and S-AMP, respectively. Clinically, ADSL-deficient patients display mainly neurological symptoms, with a widely variable degree of psychomotor retardation that seems to correlate with the S-Ado : SAICAriboside ratio in their body fluids. In view of this wide variability, the first part of this work attempted to establish genotype-phenotype correlations in ADSL-deficient patients (Chapter 4). Recombinant mutated ADSL enzymes were expressed and their properties studied. A first group of mutations leads to the production of thermolabile proteins with activities decreased in parallel for both substrates, SAICAR and S-AMP, or more for SAICAR than for S-AMP. ADSL activities measured in fibroblasts of patients homozygous for one of these mutations, R426H, are in agreement with the activities of the corresponding recombinant mutated protein. These patients have a S-Ado to SAICAriboside ratio of ~1, and are profoundly retarded. The second group of mutations leads to the production of thermostable proteins, though with a much more pronounced decrease in the activity toward S-AMP than toward SAICAR. Fibroblasts of patients homozygous for one of these mutations, R303C, also display ADSL activities similar to those of the recombinant mutated protein. These patients have a S-Ado to SAICAriboside ratio between 3 and 4 and are mildly retarded. These results suggest that the nature of the genetic lesion of ADSL determines the ratio of its activities with S-AMP versus SAICAR, which in turn defines the S-Ado:SAICAriboside ratio and the patients’ mental status. The second part of this work was devoted to the elucidation of the pathophysiologic mechanisms of this neurological disease. Two main hypotheses were tested. Since the ratio of succinylpurines correlates with the severity of the phenotype, we first privileged the hypothesis that SAICAriboside is the neurotoxic compound and, that S-Ado counteracts its noxious effect (Chapter 5). Along this line, three different approaches were considered: succinylpurines could (1) interact with the ionotropic glutamate receptor N-methyl-D-aspartate (NMDA), (2) inhibit the hydrolysis of N-acetyl-aspartate (NAA) and provoke an accumulation of this compound as in Canavan disease, (3) be toxic only during brain maturation. Results show that succinylpurines do not interfere with NMDA receptors or with NAA metabolism, but indicate that they could be toxic on undifferentiated neurons. The second pathophysiological hypothesis involves the possibility that the ADSL defect could lead to deficiency of purine, particularly adenine nucleotides (Chapter 6). Therefore, purine nucleotide concentrations were measured in ADSL-deficient patients’ fibroblasts with very low residual ADSL activity (less than 10% of control). In order to render these cells more dependent on purine de novo synthesis, they were also cultured in medium depleted in purine bases needed for the salvage pathway. Nevertheless, in comparison with control fibroblasts, no reduction of the nucleotide concentrations in the ADSL-deficient fibroblasts could be detected. Although this study failed to elucidate the cause of the neurologic symptoms in ADSL deficiency, it has led to new insights in the mechanisms involved in the dephosphorylation of the two substrates of ADSL. ...