Mécanismes de contrôle du potentiel de membrane de la cellule à insuline par le glucose et l'acétylcholine

During the feeding periods, the increase in glycemia is limited in time and amplitude by the hypoglycemic action of insulin that is secreted by pancreatic beta cells. These latter are electrically excitable and their membrane potential and electrical activity are primarily controlled by glucose. These effects have mainly been characterized in mouse islets in which, in the presence of a non-stimulating concentration of glucose (< or = to 6 mM), the membrane potential is at the resting level. When the glucose concentration increases (> or = to 7 mM), the acceleration of glucose metabolism inside the beta cell increases the ATP/ADP ratio, which closes the ATP-sensitive K+ channels (K+-ATP channels). This leads to depolarization of the plasma membrane and an oscillating electrical activity starts. Each oscillation of the membrane potential, usually referred to as a slow wave, consists of a depolarized phase on top of which a train of action potentials appears, and a repolarized phase without action potential. Glucose modulates the duration of the slow waves that become longer, with little change in their frequency, as its concentration increases (between 7 and 25 mM). When this concentration exceeds 25 mM, slow waves are transformed into a sustained depolarization with continuous spike activity. The changes in membrane potential are crucial for the control of beta cell function because each depolarization induces a concomitant rise in the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c) which is the triggering signal for insulin secretion. Whereas it is unanimously admitted that the rise in the ATP/ADP ratio triggers the initial depolarization, via the closure of K+-ATP channels, the mechanisms driving the partial repolarization at the end of each slow wave has escaped identification. Among numerous hypothesis, it has been proposed that metabolic oscillations (intrinsic or dependent of [Ca2+]c) drive oscillation of the K+-ATP channels activity. To verify this hypothesis and evaluate the role of K+-ATP channels in the control of the partial repolarisation, we measured the K+-ATP current (IKATP) using the perforated configuration of the patch-clamp technique (voltage-clamp). No oscillations of IKATP were observed when glucose-stimulated beta cells were kept hyperpolarized, thus with low and stable [Ca2+]c. These results suggest that, in the absence of [Ca2+]c oscillations, no intrinsic metabolic oscillations affect IKATP in pancreatic beta cells. Conversely, increasing [Ca2+]c by Ca2+ influx (depolarizing pulses) or Ca2+ mobilization (acetylcholine) transiently augmented IKA

Lors des repas, l'augmentation de la glycémie est limitée en temps et en amplitude par l'action hypoglycémique de l'insuline qui est sécrétée par les cellules beta pancréatiques. Ces dernières sont électriquement excitables et leur potentiel de membrane ainsi que leur activité électrique sont majoritairement contrôlés par le glucose. Ces effets ont été principalement caractérisés chez la souris. En présence d'une concentration non-stimulante de glucose (inférieure ou égale à 6 mM), la membrane plasmique de le cellule beta est maintenue au repos. Quand la glycémie augmente (supérieure ou égale à 7 mM), l'accélération du métabolisme cellulaire augmente le rapport ATP/ADP qui entraîne la fermeture des canaux K+ sensibles à l'ATP (canaux K-ATP). Ceci conduit à la dépolarisation de la membrane plasmique et à l'apparition d'une activité électrique. Chaque oscillation du potentiel de membrane (ou slow-wave) comprend une phase de dépolarisation au sommet de laquelle apparaissent des potentiels d'action, et une phase de repolarisation sans potentiel d'action. Le glucose module la durée des « slow-waves » qui deviennent de plus en plus longues (sans changement majeur de leur fréquence) au fur et à mesure que la glycémie augmente. Quand la concentration en glucose dépasse 25 mM, les phases de repolarisation disparaissent. Les changements du potentiel de membrane sont cruciaux dans le contrôle de la fonction des cellules beta puisque chaque dépolarisation induit une élévation simultanée de la concentration cytosolique de Ca2+ ([Ca2+]c) qui représente le signal déclenchant de la sécrétion. Si il est communément admis que l'élévation du rapport ATP/ADP induit la dépolarisation initiale, le (ou les) mécanisme(s) conduisant à la repolarisation partielle lors d'une « slow-wave » sont sujet à débat. Selon une des nombreuses hypothèses proposées, des oscillations du métabolisme (intrinsèques ou dépendantes de la [Ca2+]c) entraîneraient des oscillations de l'activité des canaux K-ATP. Pour vérifier le bien-fondé de cette hypothèse et afin d'évaluer le rôle des canaux K-ATP dans le développement de la repolarisation partielle, nous avons utilisé la technique du patch-clamp (configuration cellule entière « perforé ») pour mesurer le courant K-ATP (IKATP). En présence de 10 mM de glucose, aucune oscillation d'IKATP n'a pu être observée quand les cellules étaient maintenues hyperpolarisées c'est-à-dire lorsque la [Ca2+]c est maintenue stable et basse. Ces résultats suggèrent qu'en absence d'oscillations de la [Ca2+]c, aucune oscillation intrinsèque du métabolisme ne module l'activité des canaux K-ATP. Au contraire une élévation de la [Ca2+]c suite à un influx de Ca2+ (dépolarisation) ou à une mobilisation de Ca2+ (acétylcholine) augmente transitoirement IKATP. Cet effet est aboli par le tolbutamide et prévenu par l'abrogation de l'augmentation de la [Ca2+]c, ce qui démontre que le courant augmenté est réellement IKATP et que cette augmentation est dépendante de l'élévation de la [Ca2+]c. Des expériences complémentaires ont montré que l'injection d'un courant hyperpolarisant dont l'amplitude correspond à l'augmentation d'IKATP induite par l'élévation de la [Ca2+]c est suffisante pour repolarisée des cellules beta stimulées par le glucose. Le mécanisme de rétrocontrôle que nous proposons est le suivant : l'accélération du métabolisme cellulaire du à l'élévation de la glycémie augmente le rapport ATP/ADP qui entraîne la fermeture des canaux K-ATP et la dépolarisation de la membrane plasmique ; une fois atteint le seuil d'activation des canaux calciques voltage-dépendants (CCVD), ces derniers s'ouvrent ce qui conduit à un influx massif de Ca2+. L'élévation de la [Ca2+]c induit une réouverture des canaux K-ATP (phénomène démontré par cette étude), une repolarisation partielle de la membrane plasmique, un arrêt de l'influx calcique et une diminution de la [Ca2+]c. L'éventuelle restauration, glucose-dépendante, d'un rapport ATP/ADP élevé permet à un nouveau cycle de débuter. Ce modèle permet également d'expliquer l'allongement des phases de dépolarisation lors des « slow-waves » au fur et à mesure que la glycémie augmente. Une activité électrique continue est observée lorsque la fermeture des canaux K-ATP entraînée par le glucose est telle qu'elle ne peut être contrecarrée par le rétrocontrôle induit par l'élévation de la [Ca2+]c. En plus du glucose, d'autres agents physiologiques (hormones, neurotransmetteurs) modulent également la sécrétion d'insuline. Les îlots de Langerhans sont richement innervés par les systèmes parasympathique et orthosympathique qui régulent finement la sécrétion d'insuline. L'acétylcholine (ACh) est libérée par le système parasympathique durant la phase pré-absorptive avant même l'augmentation de la glycémie et lors de la phase absorptive. Parmi les nombreux effets exercés au niveau de la cellule beta, l'ACh en se liant à un récepteur muscarinique dépolarise la membrane plasmique. Dans les cellules non stimulées par le glucose, cette dépolarisation est limitée et ne permet pas d'atteindre le seuil d'activation des CCVD et n'induit par conséquent aucun influx calcique. Au contraire, en présence d'un concentration stimulante de glucose, la dépolarisation supplémentaire induite par l'ACh entraîne un influx calcique et une élévation soutenue de la [Ca2+]c. Malgré l'importance de ce courant dans l'effet global de l'ACh sur la sécrétion d'insuline (stimulation), celui-ci n'a jamais été identifié. Plusieurs observations néanmoins suggéraient qu'il s'agissait d'un courant sodique. En effet, la dépolarisation est accompagnée par une augmentation de la capture de 22Na+, du contenu global en Na+ et de la concentration cytosolique de Na+ ([Na+]c). Lors de cette étude, nous avons utilisé les techniques de microélectrode intracellulaire et de patch-clamp afin d'identifier et de caractériser le courant dépolarisant induit par l'ACh dans les cellules beta pancréatiques. Ainsi, nous rapportons les premières preuves électrophysiologiques que l'ACh, suite à sa liaison à un récepteur muscarinique, active indépendamment des protéines G, un courant sodique entrant que nous avons appelé INa-ACh. Les canaux portant cette conductance sont insensible à un inhibiteur des canaux sodiques voltage-dépendant, la tétrodotoxine, possèdent la propriété de rectification entrante et répondent à l'ACh d'une manière concentration dépendante. De plus, nous montrons avec cette étude que l'amplitude d' INa-ACh est suffisante pour expliquer les effets de l'ACh sur la [Na+]c et le potentiel de membrane dans les cellules beta pancréatiques. En effet, l'injection d'un courant dépolarisant dont l'amplitude est similaire à celle induite par l'application d'1 microM du neurotransmetteur induit une activité électrique dans des cellules périfusées par 6 mM de glucose.