Liaison, mode d'action et synergie de la virginiamycine S : un inhibiteur de la synthèse protéique bactérienne

The Streptogramin family of antibiotics, which include the virginiamycin, is composed of two groups of chemically unrelated compounds: type A; such as virginiamycin M (VM), and type B, such as virginiamycin S (VS). Both types of Streptogramins are simultaneously produced by Streptomyces. Each single type of compound reversibly inhibits growth of gram positive bacteria, whereas their synergistic action on protein synthesis induces a bactericidal effect.
The present work was focused on virginiamycine S. Its aim was explore the binding of this antibiotic to ribosome and its autonomous and synergistic (with VM) action. This research was divided in four distinct parts, each delineated in one of the following paragraphs.
A cell-free polypeptide synthesis system, based on the translation of several two-base random copolymers, was developed to study the mode of action of virginiamycine S on the translation elongation step. Under these conditions, VS-induced inhibitory action increased with the polymerization reaction rate and the peptide size. The slowing down of synthesis due to virginiamycine S was related to a decreased efficiency of peptide bond formation. In addition, VS was able to stimulate a premature release of peptidyl-tRNA. This premature release was dependent on the nature of the C-terminal amino acid residue of the growing peptidyl chain. All these effects might be due to the local conformational change induced by binding of the antibiotic to ribosome. This change would result in altered interaction between peptidyl-t-RNA and the donor site of peptidyltransférase. Moreover, contrary to VM, VS was able to act on translating ribosomes. Using the same approach, it was shown that erythromycin (M14 MAcrolide) exerts a similar mode of action. Location of the VS binding site into the bacterial ribosomal three-dimensional structure was investigated by identifying its constitutive ribosomal proteins. Therefore, ribosome affinitu labelling was performed with a VS derivative (N-hydroxysuccinimide ester, VSE) able to covalently link with amino groups of proteins. Identification of affinity-labeled proteins, using the VSE derivative, was performed by an immunoenzymometric procedure. A aspecific linkage of VSE with a restricted region of the large ribosomal subunit was observed. The fact that more than 80% of the label was associated with both L18 and L22 proteins argues for the contribution of both these proteins to the VS binding site and, indirectly, to the peptidyltransférase domain of bacterial ribosomes. No modification of the labelling pattern was observed when the coupling reaction was performed in presence of virginiamycine M, which is otherwise known to induce a conformational change to the VS binding site. In view of the literature data, giving direct or indirect information on the location of L18 and L22 into the three-dimensional structure of ribosome, these results indicate that that VS binding site is situated at the base of the central protuberance of the 50S subunit, the purative location of peptidyltransférase domain.
Understanding of the molecular interactions between VS and ribosomes was further expanded here to the role played by a bivalent cation in VS binding. This part of the study was based on the increase in intensity of the intrinsic fluorescence of VS when chelated to alkaline earth cations or bound to ribosomes. Fluorescence lifetime measurements, equilibrium titrations and stopped-flow spectrofluorometry allowed to observe VS•MG²+ dissociation in the presence and absence of ribosome. Our results strongly suggest that the interaction between VS and ribosome is partly provided by a salt bridge between suitable acceptor atoms of the ribosome and the 3-OH-picolinyl residue of VS.
The study of VS inhibitory action was completed by an analysis of the in vivo synergistic action mechanism observed in the presence of VS and VM. Synergistic effect on bacterial growth was shown to require the simultaneous presence of both components to the active ribosomal population. VM concentration constituted the limiting factor of the synergic reaction. The decrease in bacterial viability was related to both protein synthesis inhibition and antibiotic-ribosome binding of type A Streptogramins of the ribosomes. It also clearly excludes a catalytic mode of VM promoted effect in ribosome affinity for VS? On the other hand, VS, which did not directly affect the association constant of VM to ribosomes, promotes the binding of VM by inducing the premature release stimulation of peptidyl-tRNA. Accordingly, a model was elaborated founding the synergistic mechanism on the sudden inhibition of polysomes. Therefore, the functional ribosomal population would rapidly decrease, leading to a dramatic loss of cellular viability

Les antibiotiques de la famille des Straptogramines, à laquelle appartient la virginiamycine, sont formés de deux molécules chimiquement distinctes. Les Streptogramines de type A (virginiamycine M ; VM) et de type B (virginiamycine S, VS) sont produites simultanément par des Streptomyces. Elles peuvent induite isolément un blocage de la multiplication des bactéries gram positives (effet bactériostatique) mais sont également capables d’agir en synergie. Cette action synergique est à la fois quantitative (réduction d’un facteur cent de la concentration minimale inhibitrice de chaque composé) et qualitative (transformation d’un effet bactériostatique en une inhibition bactéricide).
La finalité des travaux présentés consistait en l’étude du comportement de la virginiamycine S lors de sa liaison au ribosome et aux cours de son action isolée et synergique. Cet objectif a été poursuivi au travers de quatre thèmes de recherche.
La mise au point d’un système protéique acellulaire, basé sur la traduction d’ARNm synthétiques formés de deux nucléotides associés selon un ordre aléatoire, permit d’étudier in vitro l’action de la virginiamycine S sur l’étape d’élongation de la traduction. Dans un contexte expérimental, le taux d’inhibition induit par VS augmentait avec la cinétique de polymérisation et la taille du peptide formé. L’antibiotique provoquait un ralentissement de la taille du peptide formé. L’antibiotique provoquait un ralentissement de la synthèse, lié à une diminution de l’efficience de la réaction de formation du lien peptidique. Par ailleurs, la nature des acides aminés incorporés déterminait la capacité de VS à stimuler le décrochage prématuré du peptidyl-ARNt. Ces différents effets tenaient au changement de conformation local survenant lors de la liaison de l’antibiotique au ribosome. Il en résultait une détérioration de l’interaction entre l’extrémité peptidyl de l’ARNt et le site donneur de la peptidyltransférase. De plus, contrairement à la virginiamycine M, VS était capable de se lier et d’agir sur des ribosomes ayant déjà amorcé un cycle de traduction et se trouvant, de ce fait, associés en polysomes. Parallèlement à cette étude, il est apparu que l’érythromycine (Macrolie M14) adoptait un mécanisme d’action commun à celui de la virginiamycine S.
La localisation du site de liaison de VS au sein de la structure tridimensionnelle du ribosome a été recherchée par le biais de l’identification de protéines ribosomales le constituant. A cette fin, le marquage d’affinité du ribosome a été réalisé au moyen d’un dérivé chimique de l’antibiotique (N-hydroxysuccinimide ester, VSE), capable d’établir un lien covalent entre les fonctions amines libres des protéines. La mise en évidence des protéines coulées au dérivé de VS fut obtenue à l’aide d’anticorps dirigés contre l’antibiotique. Il résulta de cette étude que l’antibiotique était exclusivement couplé aux protéines de la grande sous-unité du ribosome et que plus de 80% de VSE étaient associés aux deux composants L18 et L22 de la sous-unité 50S, ce qui les identifiait comme participant à la constitution du site de liaison de VS et, indirectement, à celle du domaine de la peptidyltransférase. La fixation de la virginiamycine M au ribosome, préalablement au couplage de VSE, ne modifiait pas la nature des protéines révélées. La localisation directe ou indirecte de ces protéines au sein de la structure tridimensionnelle du ribosome étant connue, le site de liaison de VS fut localisé à la base de la protubérance centrale de la grande sous-unité ribosomale, dans une zone réputée appartenir au domaine de la peptidyltransférase.
La compréhension des interactions unissant VS au ribosome a été approfondie en évaluant le rôle qu’y tenait un cation bivalent. Cette étude a été fondée sur la modification d’intensité de la fluorescence naturelle de VS lors de son interaction avec certains ions ou avec le ribosome. Par l’estimation de temps de vie de fluorescence et par des mesures spectrofluorimétriques, la dissociation du complexe formé entre VS et le Mg2+ a été suivie en présence et en absence de ribosome. La comparaison des différentes constantes cinétiques et d’équilibre mesurées a permis de conclure que VS se liait au ribosome sous la forme d’un complexe avec le Mg2+. Ce complexe impliquait le groupement 3-OH-picolinyl de VS, par ailleurs responsable de la fluorescence naturelle de l’antibiotique. La stabilisation de VS au sein de son site de fixation reposait partiellement sur l’établissement d’un pont salin, assuré par le Mg2+, entre le groupement 3-OH-picolinyl de VS et un constituant ribosomal.
L’étude du comportement de la virginiamycine S a été élargie à l’analyse du mécanisme par lequel elle agissait en synergie avec VM. Il a été montré que l’inhibition synergique impliquait la disponibilité simultanée de VS et VM vis-à-vis de la population ribosomale active. Dans ces conditions, la concentration de VM constituait le facteur limitant de la réaction d’inhibition. L’altération de la viabilité cellulaire évoluait parallèlement à la capacité de synthèse protéique de la population bactérienne traitée. Elle était également proportionnelle au taux de ribosomes extraits auxquels VS et VM étaient liées. L’augmentation d’affinité de VS pour son site de fixation ribosomal, induite lors de liaison de VM, avait initialement été mise en évidence sur des ribosomes isolés. Cette notion était vérifiée in vivo mais, contrairement à ce qui avait été établi antérieurement, une molécule de VM ne pouvait modifier qu’un seul ribosome auquel elle se liait de façon très stable. A l’inverse, VS n’influençait pas directement la constante d’association de VM au ribosome mais rendait accessible à VM une partie de la population ribosomal initialement protégée. Ces données ont permis d’élaborer un modèle fondant le mécanisme de la synergie sur l’inhibition des ribosomes associés en polysomes, dont découlerait une diminution très rapide de la population de ribosomes fonctionnels, entraînant la perte de viabilité cellulaire