Métabolisme du glycogène chez saccharomyces cerevisiae

Ce travail est consacré à l’étude du métabolisme du glycogène chez la levure et de son contrôle par le glucose et au cours de la croissance cellulaire. Il comprend une « Introduction générale », de nature bibliographique, une section « Résultats », qui décrit notre apport personne au problème étudié, une « Discussion et une section intitulée (Matériel et méthodes », qui rapporte notre approche expérimentale.
L’introduction fait le point de la littérature à propos des différents sujets qui seront abordés expérimentalement. Nous y rappelons les principales propriétés des levures, qui en ont fait un modèle biologique très étudié. Nous décrivons ensuite les grandes étapes de l’utilisation du glucose ainsi que de la gluconéogenèse en général, en soulignant les particularités propres à la levure. Parmi celles-ci , mentionnons la complexité des transporteurs transmembranaires du glucose et de leur relation avec les différents types d’hexokinase ; mentionnons aussi la propriété de la PFK2 d’être activée par phosphorylations sous l’action de la protéine-kinase dépendante de l’AMP cyclique, alors que l’enzyme homologue de foie est inactivée dans les mêmes conditions. La structures ainsi que les voies de synthèse et de dégradation du glycogène sont apparemment les mêmes chez la levure et chez les mammifères ; dans les deux cas, l’activité de la glycogène-synthase et celle de la glycogène-phosphorylase déterminent respectivement les vitesses de synthèse et de dégradation du polysaccharide. La principale différence réside dans le mécanisme de contrôle de chacune de ces deux enzymes, mécanisme qui, dans le cas des levures, reste encore très mal défini.
La glycogène-phosphorylase, enzyme-clé de la dégradation du glycogène dans toutes les cellules animales, a été purifiée à partir de levure par plusieurs groupes d’auteurs et, bien que de nombreuses incertitudes subsistent, ses propriétés cinétiques sont en grandes partie connues. Nous passons ensuite en revue les principales protéines-kinases connues et qui seraient susceptibles de modifier l’activité tant de la glycogène-synthase que de la glycogène-phosphorylase en leur transférant un groupement phosphatez terminal d’ATP sur un résidu sérine ou thréonine. Certaines de ces protéine-kinases sont dépendantes de l’AMP ou du GMP cycliques, d’autres du calcium ; parmi ces dernières une mention spéciale est faite à la protéine-kinase C et surtout à la phosphorylase-kinase.
Les protéine-phosphatases, dont l’action s’oppose à celle des protéine-kinases, ne sont que très imparfaitement connues, aussi bien chez les mammifères que chez la levure. Un mutant de S. cerevisiae a été décrit comme étant déficient en protéine-phosphatase et, à ce titre, a retenu notre attention en tant que modèle expérimental d’un grand intérêt potentiel. Malheureusement, les auteurs qui avaient rapporté ces résultats se sont par la suite rétractés.
La section Résultats est elle-même subdivisées en trois parties.
Dans la première partie nous analysons l’effet de l’addition de glucose à une suspension de levure. Ce glucose se transforme essentiellement en éthanol et aussi, après une courte latence en glucogène. Dans les quelques minutes qui suivent l’addition de glucose, on assiste à une inactivation progressive de la glycogène-phosphorylase ainsi qu’à l’activation de la glycogène-synthase. Ces modification d’activité enzymatique, qui persistent après une filtration sur gel, font suite à une augmentation d’environ 10 fois de la concentration des hexoses-phosphates intracellulaires ainsi que, paradoxalement, de l’AMP cyclique. Des modifications enzymatiques analogues sont observées après addition, à la suspension de cellules, de fructose, de mannose ou d’un analogue du glycose susceptible de donner naissance dans la cellule à un 6-phosphoester.
Lorsque le glucose est ajouté à une suspension du mutant pgi, déficient en glucose-6-phosphate-isomérase, tant les modifications enzymatiques mentionnées plus haut que l’accumulation de glucose-6-phosphate sont beaucoup plus rapides et plus intenses que dans la souche sauvage. La synthèse de glycogène se fait cependant à une vitesse normale. L’addition de fructose au même mutant cause une très forte accumulation de fructose-1,6-biphosphate, mais aucune synthèse de glycogène. Dans les deux cas, la concertation en ATP tombe à des valeurs très basses.
Lorsque le glucose est ajouté à une suspension du mutant thermosensible cdc35, déficient en adénylate-cyclase, à la température restrictive de 37°C, les changements d’activité enzymatique sont aussi beaucoup plus intenses que dans la souche sauvage.
Finalement l’addition de glucose à une suspension du mutant ppd1, réputé déficient en protéine-phosphatase n’a provoqué aucune modifications enzymatiques attendues, en dépit d’une accumulation normale de glucose-6-phosphate. La même anomalie était aussi observée chez la souche contrôle PPD1.
Dans la deuxième partie de la section R2sultats, nous avons étudié les propriétés de la glycogène-phosphatase de levure et de ses enzymes convertantes, phosphorylase-phosphatase et phosphorylase-kinase. Nous avons purifié la glycogène-phosphorylase. Nous avons purifié la glycogène-phosphorylase à partir de la souche cdc35 préincubée en l’absence de glucose, préparation qui contient l’enzyme presqu’entièrement sous sa forme a. Notre enzyme purifié était libre de protéine-phosphatase. Nous l’avons aussi utilisée à vérifier quelques propriétés cinétiques de la glycogène-phosphorylase elle–même. Les propriétés de la phosphorylase-phosphatase de levure ont été étudiées en utilisant comme substrat soit la glycogène-phosphorylase présente dans l’extrait, soit l’enzyme partiellement purifiée. La caractéristique la plus importante de cette enzyme est d’être dépendante du glycose-6-phosphate, dépendance qui était presque totale dans certaines expériences et seulement partielle dans d’autres. L’enzyme est aussi partiellement inhibée par des ions bivalents tels que Mg++, Mn++ et Zn++. L’action de Mg++ est surtout de contrecarrer l’effet positif du glycose-6-phosphate ; celle de Zn++ est relativement faible lorsque le glycose-6-phosphate est présent et est beaucoup moins importante que celle du même ion d’inhiber l’hydrolyse de l’histonephosphate. Par chromatographie sur DEAE-trisacryl, nous avons séparé deux pics de phosphorylase-phosphatase qui se distinguaient surtout par leur dépendance vis-à-vis du glycose-6-phosphate, laquelle était presque complète pour le premier pic et seulement partielle pour le second. Une histone-phosphatase était éluée entre les deux pics de phosphorylase-phosphatase.
Étant donné que la phosphorylase b de levure est quasi complètement inactive, nous n’avons pas pu purifier cette enzyme pour nous en servir comme substrat de la phosphorylase-kinase. Notre étude de cette dernière enzyme a donc été entièrement réalisée avec un extrait de levure. Dans cette préparation, nous avons pu observer une activation de la phosphorylase, dépendante de la présence d’ATP-Mg et simulée par l’ion Ca++, mais non influencée par la présence d’AMP cyclique.
Dans la troisième partie de la section R2sultats, nous avons étudié l’état d’activation de la glycogène-phosphorylase et de la glycogène-synthase au cours de la croissance. Chez la souche sauvage, les deux enzymes sont synthétisées en parallèle avec l’apparition du glycogène, c.-à-d. en fin de croissance logarithmique. Toutefois, alors que la glycogène-phosphorylase reste essentiellement sous sa forme inactive, la glycogène-synthase est presque entièrement activée au moment où la synthèse de glycogène est la plus importante.
Dans la section Discussion, nous nous efforçons de tirer les conclusions les plus importantes de notre travail et de souligner notre apport personnel. Il apparaît clairement de l’ensemble de notre étude réalisée in vivo, tant avec la souche sauvage qu’avec les mutants pgi et cdc35, que la forte augmentation de concentration en glycose-6-phosphate qui fait suite à l’addition de glucose à une suspension de levures est le facteur essentiel qui détermine l’inactivation de la glycogène-phosphatase et l’activation de la glycogène-synthase. Les expériences avec le mutant cdc35 indiquent d’autre part que l’action du glucose n’est pas médiée par la formation d’AMP cyclique qu’il provoque, mais que par contre l’absence de formation du nucléotide cyclique favorise grandement l’action du glucose.
Alors que le rôle du glycose-6-phosphate sera largement confirmé par son action de stimuler les protéine-phosphatases, celui de l’AMP cyclique restera mystérieux, vu notre incapacité à mettre en évidence un effet de ce nucléotide sur l’activation de la glycogène-phosphorylase dans une extrait de levure incubé en présence d’ATP-Mg.
Dans la section Matériel et Méthodes, nous décrivons les différentes souches de levure que nous avons utilisées, parmi lesquelles une série de mutants, ainsi que les méthodes de culture et d’extraction des cellules et aussi la purification de certaines enzymes à partir des extraits obtenus. Nous rapportons aussi les méthodes analytiques utilisées pour la mesure des activités enzymatiques et pur celle de la concentration de divers métabolites. Nous décrivons finalement l’origine de tous les produits utilisés ainsi que les méthodes par lesquelles nous avons préparé de l’ATP[γ-32P] et de l’histone[32P]