Prevention of cancer development by the antigen 60 mycobacterial complex and of cancer-promoted inhibition of immune reactions

La deuxième partie de notre travail concerne l’effet inhibiteur du cancer sur l’immunité humorale. La synthèse d’immunoglobulines spécifiques anti-A60 a été mesurée chez les souris sensibilisées à l’A60 et développant une tumeur EMT 6. Dans ces souris, la synthèse d’IgG anti-A60 s’amorce normalement, mais elle diminue brusquement une semaine après l’inoculation de cellules cancéreuses pour atteindre, deux semaines plus tard, le niveau de base. Par contre, chez les souris ne développant pas de tumeurs, la courbe de synthèse des IgG anti-A60 se superpose à celle du groupe de référence (animaux recevant l’A60 mais pas les cellules EMT 6). Dans une étude complémentaire, nous avons observé que ‘l’implantation du cancer au moment où la synthèse d’IgG anti-A60 a atteint son niveau maximum n’est pas suivie par la chute d’IgG observée lors de inoculation précoce de cellules cancéreuses. Nous avons remarqué que, après contact in vitro avec des cellules EMT 6, la prolifération des cellules B spléniques est significativement réduite, alors qu’une diminution de leur production d’anticorps ne peut être démontrée (résultats non publiés). Ces observations indiquent que les cellules tumorales n’exercent pas d’action inhibitrice majeure sur les fonctions des cellules B. Toutefois, nous avons remarqué qu’un contact transitoire avec des cellules EMT 6 in vitro réduit fortement la prolifération de lymphocytes T spécifiques (issus des ganglions lymphatiques de souris injectées avec l’A60) ainsi que leur capacité d’induire l’expansion clonale des cellules B. Il en découle que les cellules tumorales exercent plutôt un effet indirect sur les cellules B, par l’intermédiaire des lymphocytes T activateurs.
Au niveau moléculaire, l’altération du système immunitaire humoral induite par le tumeur EMT 6 a été étudiée par l’analyse de la production des cytokines interleukine-2, interféron-γ et tumor necrosis factor-α in vivo et in vitro. Dans le sang des souris immunisées avec l’A60 on enregistre des taux élevés d’interleukine-2 qui disparaissent progressivement lors du développement tumoral. En présence d’A60, les cultures lymphocytaires hématiques et lymphatiques de souris immunisées produisent des concentrations élevées de cette même cytokine, qui diminuent sensiblement suite à la co-incubation des lymphocytes avec les cellules EMT 6. On peut en conclure que les cellules cancéreuses, en inhibant la synthèse d’interleukine-2 par les cellules T, bloquent la prolifération clonale des lymphocytes B et, donc, la production d’immunoglobulines.
La conclusion de cette deuxième partie est donc la suivante. Le développement d’une tumeur EMT 6 produit un effondrement de l’immunité humorale lorsque l’inoculation de cellules tumorales suit de près celle d’A60. Cet effondrement n’apparaît pas, au moins à moyenne échéance, lorsque les cellules tumorales sont injectées après que la réponse humorale secondaire soir bien développée. Nous proposons donc qu’une action indirecte des cellules tumorales sur les lymphocytes B ; s’exerçant par l’intermédiaire des lymphocytes T helper, et de la production d’interleukine-2 par ces cellules, soit l’effet dominant du cancer sur le système immunitaire humoral.
Dans la troisième partie de notre travail, les altérations de l’immunité cellulaire produites par le cancer on été mises en évidence par des réactions d’hypersensibilité retarde chez les souris traitées à l’A60, inoculées avec des cellules EMT 6 et porteuses de tumeurs. Cette étude montre un effondrement progressif de l’immunité à médiation cellulaire, à partir de la deuxième semaine du développement tumoral. A la fin du deuxième mois, les réactions d’hypersensibilité retardée contre l’A60 n’étaient plus décelables. Les réactions d’hypersensibilité retardée sont des phénomènes complexes dus à l’interaction de multiples lignées cellulaires, surtout des lymphocytes T et des macrophages, à une modification de la vascularisation des tissus, et à la production de plusieurs médiateurs. Chez les souris développant une tumeur, nous avons observé (en parallèle avec un déclin des réactions d’hypersensibilité retardée) une disparition progressive de lymphocytes T répondant à l’A60 et des macrophages activés par l’injection d’A60. Toutes les fonctions spécifiques des macrophages activés sont supprimée après incubation avec des cellules EMT 6, qu’il s’agisse de la cytolyse de cellules tumorales ou de la production de radicaux d’oxygène ou de NO2, indiquant que les cellules tumorales exercent un effet direct sur les macrophages. D’autre part, les expériences de transfert adoptif ont clairement montré que les macrophages seuls, quoi qu’augmentant le temps de survie, ne confèrent pas de protection anti-tumorale aux souris receveuses irradiées. Les cellules tumorales peuvent donc interférer avec le processus d’activation des macrophages par les lymphocytes T. En effet, lorsque l’activation des macrophages est promue par des lymphocytes T incubés avec des cellules EMT 6, l’action cytolytique des macrophages est fortement diminuée.
Les bases moléculaires de l’action inhibitrice exercée par le cancer sur l’immunité cellulaire ont été analysées par des expériences in vivo et in vitro de titrage de cytokines. Les niveaux hématiques d’interleukine-2 et d’interféron-γ se sont montrés très élevés après l’injection d’A60 et sont suivis d’une chute suite au développement tumoral. La synthèse de ces deux cytokines a été stimulée par l’A60 dans els cultures lymphocytaires, mais aussi dans les cellules EMT 6. Un phénomène identique a été observé avec la production de tumor necrosis factor-α, non seulement dans les cultures lymphocytaires, mais aussi dans les cultures de macrophages. Puisque l’interleukine-2 prend part à l’activation des lymphocytes T (particulièrement des types natural killer, lymphokine-activated killer et lymphocytes T cytolytiques), que l’interféron-γ active les macrophages, que le tumor necrosis factor-α agit sur les cellules tumorales et que les macrophages activés causent la cytolyse des cellules tumorales, nos expériences dévoilent la stratégie employée par la cellule cancéreuse pour échapper à la surveillance immunitaire et à l’action anti-tumorale de l’A60.
Nous concluons, de cette troisième partie, que l’anergie de l’immunité cellulaire qui se manifeste pendant la croissance tumorale est causée d’une part par une inhibition directe de l’activité des macrophages par les cellules tumorales et d’autre part par une action indirecte : l’inhibition des cellules T activatrices des macrophages à travers l’inhibition de la production d’ienterleukine2 et d’interféron-γ
Dans notre travail, l’A60 a été employé avec succès pour réaliser une immuno-prophylaxie du cancer expérimental, en association ou non avec d’autres substances anticancéreuses. L’action prophylactique de l’A60 sans adjuvant indique que ce complexe immun pourrait être utilisé en thérapie humaine. L’activation de cellules cytolytiques, principalement les macrophages et secondairement les lymphocytes T cytolytiques, par l’induction de la production de cytokines à effet anti-tumoral indirect (interleukine-2 et interféron-γ), et la production de cytokines à effet direct, principalement le tumor necrosis factor-α, paraissent être les mécanismes par lesquels l’A60 induit une protection contre la croissance tumoral.
D’autre part, les réactions immunitaires déclenchées par l’A60 ont servi à explorer l’anergie induite par le cancer. L’effondrement de la réponse humorale est attribué surtout à une action indirecte de la tumeur, ou de ses produits, sur les cellules B par l’intermédiaire des lymphocytes T helper. L’affaiblissement progressif de la réponse à médiation cellulaire s’est montré lié à une inhibition directe des fonctions du macrophage activé, ainsi qu’à une interférence avec le processus d’activation des macrophages. L’effondrement des deux parties du système immunitaire est dû à l’inhibition de la production de cytokines (interleukine-2, tumor necrosis factor-α et interféron-γ) induite par les cellules tumorales ou leurs produits.
Des expériences de typages de cellules chez les souris traités à l’A60 et développement ou rejetant une tumeur EMT 6 sont actuellement en cours. Elles pourraient préciser davantage le rôle des différentes cellules du système immunitaire dans les phénomènes qui font l’objet de ce travail

L’effet protecteur des micro-organismes du groupe CMN (Corynebacterium, Mycrobaterium, Nocardia) contre le développement du cancer a été l’objet de nombreux travaux, dont les résultats ont été contradictoires et d’interprétation difficile. La présence, dans les bactéries CMN, d’une panoplie de composants ayant parfois des effets opposés sur le système immunitaire, est à l’origine de ces résultats discordants.
Des études antérieures dans notre laboratoire ont permis la purification des complexes antigéniques majeurs des bactéries CMN appelés TMA (Thermostable Macromolecular Antigens). Dans le décours des mycobacterioses, ces complexes se sont révélés être immuno-dominants et capables d’induire des réactions immunitaires de type humoral et cellulaire. On sait, en outre, que le complexe A60 (le TMA de M. bovis BCG) protège les animaux de l’infection tuberculeuse. En effet, l’A60 stimule la prolifération de lymphocytes T spécifiques (issus de souris immunisées contre ce complexe), lesquels sécrètent de l’interféron-ɣ et de l’interleukine-2. Ces cytokines activent les macrophages, bloquant ainsi la prolifération intracellulaire de micro-organismes pathogènes. Nous avons étendu ces observations antérieures à l’étude de tumeurs expérimentales.
Notre travail est divisé en trois parties. Dans la première partie, nous avons analysé l’action protectrice de l’A60 contre le développement du cancer. Dans ce but, nous avons développé trois systèmes basés sur différentes lignées cellulaires cancéreuses, sensibles à des degrés différents à l’action prophylactique de l’A60. L’emploi du complexe A60 augmente le temps de survie des souris auxquelles une lignée tumorale allogénique (TLT) a été inoculée, sans pour autant induire une protection contre le développement des tumeurs. L’injection répétée d’A60 inhibe le développement des tumeurs expérimentales syngéniques EMT 6 et 3LL : incidence de tumeurs létales d’environ 80-100% dans les contrôles et de 30 à 40% chez les souris traités avec l’A60. L’inoculation complémentaire de cellules tumorales autologues irradiées augmente l’action inhibitrice de l’A60 et réduit l’incidence de cancers à des niveaux proche de zéro. Lors du développement tumoral chez les souris traitées avec l’A60, le tissu néoplasique apparaît isolé, entouré d’une réaction inflammatoire et infiltré par des lymphocytes et des macrophages : ces réactions immunitaires sont absentes dans les contrôles. Dans les cas de rejet, les cellules tumorales injectées ne sont plus repérables, ce qui induit à croire qu’elles ont été lysées. De plus, dans le cas de la lignée 3LL, une fibrose et des granulomes de type EMT 6, caractérisée par une incidence tumorale d’environ 100%, fut choisie pour des travaux approfondis. Comparé au BCG, l’A60 produit un effet anti-tumoral supérieur, sans pour autant induire les effets néfastes associés à l’emploi du BCG vivant (suite à une vaccination au BCG, une tuberculose généralisée a été observée chez les animaux et les humains immuno-supprimés ainsi que chez les malades atteints du SIDA). En outre, cet effet anti-tumoral est accru par l’adjonction d’acide ascorbique et de poly I :C.
Les effets anti-néoplasiques de l’A60 observés in vivo furent vérifiés par des études in vitro. Nous avons observé que l’A60 induit une activation importante de deux types de cellules pourvues de pourvoir cytolytique sur les cellules EMT6 : les lymphocytes T cytolytiques et les macrophages. La cytolyse par des phagocytes activés est apparue être environ dix fois plus importante que celle causée par les lymphocytes T cytotoxiques. Pour cerner le rôle joué par les cellules cytolytiques dans le rejet des tumeurs induit par l’A60, nous avons eu recours à des expériences de transfert adoptif de différentes cellules du système immunitaire chez des souris irradiées ; la tumeur EMT 6 fut ensuite implantée chez les souris receveuses. Cette approche a montré que l’immunité anticancéreuse est transférée par les lymphocytes stimulés par l’A60, tandis que l’injection de macrophages seuls est inopérante.
Les bases moléculaires du rejet tumoral induit par l’A60 ont été dévoilées par la détermination de cytokines produites in vivo et in vitro. Les niveaux sanguins d’interleukine-2, interféron-γ et tumor necrosis factor-α sont apparu très élevés chez les souris immunisées avec l’A60 synthétisent in vitro des fortes quantités de ces mêmes cytokines et les cultures de macrophages produisent aussi des quantités accrues de tumor necrosis factor-α. Puisque le tumor necrosis factor-α a un effet cytolytique sur les cellules cancéreuses, que l’interleukine-2 induit l’expansion clonale des lymphocytes (lymphocytes T cytolytiques, « natural killer » et ‘lymphokine-activated killers ») et que l’interféron-γ cause l’activation des macrophages, nos observations expliquent au niveau moléculaire la régression de la prolifération tumorale induite par l’A60.
La conclusion de cette première partie est que l’A60 induit le rejet du cancer en induisant une synthèse accrue d’interleukine-2, de tumor necrosis factor-α et d’interféron-γ, ainsi que la prolifération des lymphocytes T spécifiques qui, à leur tour, activent les lymphocytes T cytolytiques et les macrophages. Les cellules cytolytiques infiltrent le tissu tumoral et produisent la lyse progressive des cellules cancéreuse

The second part of our study concerns the inhibitory effect of tumor cells on the humoral immune system. The synthesis of specific immunoglobulins (anti-A60 IgG) was evaluated in A60-sensitized mice which developed EMT 6 tumors. In these mice, anti-A60 IgG synthesis started normally but suddenly dropped one week after tumor challenge: two weeks later, the IgG titers reached base levels. By contrast, in mice not developing a tumor, the pattern of anti-A60 igG synthesis paralleled that seen in the reference group (immunized with A60 but nor receiving a tumor challenge). An additional study demonstrates that a late tumor challenge (given when the synthesis of anti-A60 igG had reached maximum levels) did not induce a collapse in IgG titers as that observed after an early tumor challenge. After in vitro contact with EMT 6 cells, splenic B cell proliferation was somewhat reduced, without a major decrease in immunoglobulin production (unpublished data), thus indicating that tumor cells do not exert a major effect on B lymphocyte functions. We also found that a transient contact with ELT 6 cells reduced both the proliferation of specific R lymphocytes (from lymph nodes of mice immunized with A60) and their ability to provoke a clonal expansion of B cells. The last two observations suggested that tumor cells exerted an indirect effect on B cells, through the inhibition of activating T lymphocytes.
At the molecular level, the impact of tumor cells on the humoral immune system was analyzed by monitoring the synthesis of cytokines in vivo and in vitro. The increased level of interleukin-2 in the blood of A60-primed mice was drastically reduced in challenged animals developing a tumor. In addition, after co-incubation with EMT 6 cells, cultures of lymphatic and hematic lymphocytes synthesized far less interleukine-2 as compared to lymphocytes not exposed to tumor cells. These data indicate that tumor cells block immunoglobulin synthesis by inhibiting the T lymphocyte synthesis of interleukine-2, which promotes the clonal expansion of B cells.
The conclusions of the second part of this study are thus the following. The development of an EMT 6 tumor induces a collapse of humoral immunity when the tumor challenge follows closely the immunization with A60. This collapse is not observed when the tumor challenge is given after full development of the secondary antibody reaction. We therefore suggest that tumor cells mainly exert an indirect effect on B cells through an inhibition of activating T helper cells and of interleukin-2 production by these cells. In the thirds part of our work, tumor-induced alterations of cellular immunity were monitored by delayed-type hypersensitivity reactions in challenged A60-immunized mice developing EMT 6 tumors. This study has shown that tumor development caused a progressive collapse of cellular immunity, starting two weeks after tumor challenge. At the end of the second month, A60-elicited delayed hypersensitivity reactions became negligible. The delayed hypersensitivity reactions are complex phenomena involving several cell types, mainly T lymphocytes and macrophages, changes in tissue vascularization, and many mediators. Other tests (performed jointly with delayed hypersensitivity reaction determination) have shown, in tumor-developing mice, a progressive disappearance of both A60-responding T lymphocytes and activated macrophages. Indeed, all the specific functions of activated macrophages were suppressed after incubation with EMT 6 cells, be it tumor cell cytolysis or production of oxygen and nitrogen radicals, suggesting a direct action of tumor cells on macrophages. On the other hand, macrophages alone were not able to afford tumor protection during adoptive trials and T lymphocytes put in contact with EMT 6 cells were no longer able to activate macrophages. Thus, tumor cells also exerted an indirect effect on macrophages, by inhibiting activating T lymphocytes.
The molecular basis of tumor-promoted inhibition of the cellular immune system has been unraveled by ion vivo and in vitro experiments on cytokine production. It was found that the blood levels of interleukin-2 and interferon-γ increased after immunization of mice with A60 and sharply decreased in those mice developing a tumor after challenge with EMPT 6 cells. The in citro synthesis of these cytokines was also depressed in lymphatic and hematic lymphocytes cultures originating from A60-immunized mice and exposed to EMT 6 cells. A similar observation was made when measuring tumor necrosis factor-α production in lymphocytes and macrophage cells co-cultured with EMT 6 tumor cells. Since interleukin-2 participates in the activation of other lymphocytes (particularly of the natural killer, lymphokine activated killer and cytolytic T lymphocyte types), that interferon-γ activates macrophages, that tumor necrosis factor-α acts on tumor cells and that the activated macrophages participate in tumor cell cytolysis, these data indicate how tumor cells escape immune surveillance mechanisms and A60-promoted tumor rejection.
The conclusion of the third part of our study is that tumor-induced cellular anergy can be attributed to both a direct inhibition of macrophages functions and an indirect effect of tumor cells on macrophage-activating T lymphocytes via the inhibition of interleukin-2 and interferon-γ production. In this work, the A60 complex, in conjunction or not with other treatments, has successfully been used for immuno-prophylaxis of experimental cancer. The prophylactic action of adjuvant-free A60 is compatible with the possible use of this complex in human therapy. A6°-promoted tumor rejection is attributed mostly to the cytolytic action macrophages and secondarily to that of cytolytic T lymphocytes, as well as to increased synthesis of interleukine-2, interferon-γ and tumor necrosis factor-α.
Furthermore, the immune reactions elicited by A60 were used to explore tumor-induced immune anergy. The collapse of the humoral immune reaction is mainly attributed to an indirect effect on B lymphocytes, by interference of tumor cells, or their products, with T helper cells. On the other hand, tumor-induced cellular anergy is attributed both to a direct action of tumor cells, or their products, on macrophages, and to a tumor-induced inhibition of T cell-dependent macrophage activation. Both humoral and cellular immune collapses were linked to a tumor-induced decrease in interleukin-2, tumor necrosis factor-α and interferon-γ production.
Still progressing experiments on cell typing in A60-immunized mice developing or rejecting EMT 6 tumors may shed further light on the role of the different immune cells in the phenomena described in this thesis

The anti-tumor effect of bacteria from the group CMN (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia) has been the subject of numerous studies, which have yielded contradictory and nuclear results. The presence, in CMN bacteria, of compounds sometimes displaying opposite effects on the immune system may be the cause of these discordant results.
Previous studies in our laboratory have resulted in the purification of the major antigenic complexes from CMN bacteria, called TMA (thermostable macromolecular antigens). These complexes turned out to be immuno-dominant in mycobacterioses and able to induce humoral and cellular immune reactions. In addition, the A60 complex (the TMA of M. bovis BCG) protects animals from experimental tuberculous infections. Indeed, A60 stimulates proliferation of specific T lymphocytes (from mice immunized with the complex), which secrete interleukin 2 and interferon-γ. These cytokines activate macrophages, thus preventing intracellular proliferation of pathogenic bacteria. We have extended these observations to the study of experimental tumors.
Our work is divided in three major parts. In the first one, we analyzed the A60-ellicited protective action against tumor development. To accomplish this, we developed three systems based in different tumor cell lines sensible at different degrees to the prophylactic activity of A60. Prior immunization with A60 increased mean survival time of mice challenged with the allogenic TLT tumor line, but failed to induce rejection of this type of tumor. Repeated injection of A60 inhibited the subsequent development of the two synergic tumor lines EMT 6 and 3LL: 80-100% lethal tumor incidence in the controls and 30-40% incidence in groups treated with A60. Complementary immunization with autologous irradiated tumor cells increased the inhibition reaction and further lowered tumor incidence to a level close to 0. During tumor development in mice treated with A60, the neoplastic tissue appeared non-invasive, surrounded b an inflammatory reaction and infiltrated with several types of cells, including macrophages and lymphocytes; these reactions were not observed in the controls. In the case of tumor rejection, the injected tumor cells could not be detected, indicating that these cells were conceivably lysed. Furthermore, with the 3LL line, rejection of tumor cells was companied by fibrosis and formation of tuberculous-like granumolas. The EMT 6 line, causing an incidence close to 100% was chosen for more in depth studies. Compared to BCG, A60 induced a more effective anti-tumor effect, without causing the adverse effects associated with the use of live BCG cells, namely a lethal multiplication of mycobacterial cells (the death of immuno-depressed animals and men, notably AIDS patients has been previously reported). In addition, the prophylactic effect of A60 against cancers was increased by adjunct treatment with ascorbic acid and poly I:C.
The in vivo anti-tumor effects of A60 were confirmed by in vivo studies wherein A60 induced a large activation of cells able to cause EMT 6 cell cytolysis: cytolytic T lymphocytes and macrophages. Cytolysis by activated phagocytic cells was found to be ten times superior to that caused by cytolytic T lymphocytes. To further characterize the role of cytolytic cells in A60-induced tumor rejection, we adoptively transferred several types of immune cells from A60-primed host to irradiated mice before challenge with EMT 6 cells. This approach has shown that anti-cancer immunity was transferred by the lymphocytes, while macrophages from mice immunized or not with A60 had no effect.
The molecular bases of A60-promoted cancer rejection have been unraveled by determination of cytokine production in experiments carried out in vivo and in vitro. The blood levels of interleukin-2, interferon-γ and tumor necrosis factor-α were found to greatly increase in A60-primed mice, as compared to those found in unprimed controls. Moreover, lymphatic and hematic lymphocytes from mice injected with A60 exhibited an increased production of these three cytokines upon in vitro stimulation with A60. Since tumor necrosis factor-α exerts a cytotoxic effect on tumor cells, interleukin-2 causes the clonal expansion of lymphocytes (cytolytic T lymphocytes, natural killers and lymphokine activated killers), and interferon-γ activates macrophages, these findings account for the observed protective effect of A60 against cancer development.
The conclusion drawn from this first part is that prophylaxis with A60 induces tumor rejection by promoting the synthesis of interleukine-2, interferon-γ and tumor necrosis factor-α, as well as by causing the proliferation of specific T lymphocytes that, in turn, activate cytolytic T lymphocytes and macrophages. Cytolytic cells infiltrate the tumor mass and cause the progressive lysis of neoplastic cells.