Analyse d'une méthode originale de repliement de protéines associant le sodium dodécyle sulfate et le 2-méthyle-2,4-pentanediol

Currently, the investigation of protein refolding processes involves several time-consuming steps that require large amout of protein. In that context, it has been reported that 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD) is able to modulate the denaturing properties of sodium dodecyl sulfate (SDS) and to induce the refolding of proteins. Nonethless and even though this cosolvent effect was previously observed on the refolding of several proteins (including the lysozyme, the carbonic anhydrase, and PagP), little is known about the mechanism by which the MPD can turn the unfolding properties of SDS. The general objective of this thesis was therefore to go deeper in the understanding of the related mechanisms. In that context, a 4-steps strategy was developed: (i) the protcol was extended to the trimeric membrane protein Omp2a in order to demonstrate the transferability of the method to a multimeric protein and determine the optimal detergent/cosolvant ratio. (ii) The combination of experimental (biophysic spectroscopies) and theoretical (molecular dynamics) outputs gives us the opportunity to describe the SDS-induced unfolding states of model peptides. (iii) Then, the key role of MPD to induce the SDS micelle dissociation was unveiled by dynamic light scattering and molecular dynamics simulations. (iv) Finally, the refolding of model peptides was investigated in the presence of the detergent and the cosolvent.

(fre) La compréhension du phénomène de repliement constitue un défi majeur en biochimie structurale et en biophysique des protéines: la connaissance des mécanismes par lesquels les protéines adoptent une structure 3D particulière peut aider à comprendre et/ou prédire les fonctions des protéines. Il n'existe actuellement aucune méthode générale permettant de replier et caractériser une protéine. En effet, bien que de nombreux protocoles soient référencées dans la littérature, l'étude d'une nouvelle protéine fait, presque toujours, intervenir de nombreuses étapes préliminaires afin d'identifier les conditions permettant son repliement. Dans ce contexte, une méthode originale a récemment été mise en évidence, associant un détergent, le sodium dodécyle sulfate (SDS; connu pour ses propriétés dénaturantes), à un cosolvant, le 2-méthyle-2,4-pentanediol (MPD). Bien que cette combinaison ait préalablement été appliquée avec succès afin d'induire la renaturation de différentes protéines (lysozyme, anhydrase carbonique et PagP), les mécanismes associés sont encore peu connus. L'objectif général de cette thèse est donc d'améliorer les connaissances générales afin de pouvoir optimiser la méthode. Pour cela, une stratégie en quatre temps a été suivie: (i) L'utilisation de l'Omp2a comme modèle de protéine membranaire multimérique a permis d'identifier le rapport de concentrations entre le détergent et le cosolvant menant à un repliement optimal de la protéine. (ii) En combinant des études expérimentales (mesures biophysiques) et théoriques (dynamique moléculaire), il a été possible de caractériser le processus de dénaturation de peptides modèles dans le SDS. (iii) La dissociation de micelles de SDS par le MPD a ensuite été mise en évidence par des mesures en diffusion lumineuse dynamique et des simulations en dynamiques moléculaires. (iv) Finalement, le repliement des peptides solubles en présence du couple SDS/MPD a permis de mettre en évidence le rôle clé du MPD pour protéger les peptides de l'effet dénaturant du SDS et permettre ainsi leur repliement.