Etude des voies de réponse aux stress dans des macrophages humains différenciés en cellules spumeuses en présence de différents types de LDL, en hypoxie et en normoxie

(eng) Clinical outcomes of atherosclerosis are often due to plaque rupture. This phenomenon tends to occur in developed and unstable plaques and is favoured by death of macrophage-derived foam cells. During plaque development the death of foam cells also contributes to the formation of the necrotic core and a large necrotic core is one of the features of unstable plaques. As the death mechanisms of foams cells contribute to plaque development as well as to clinical outcomes, it is a subject of major concern. However, the study of these death phenomenons is hampered by the fact that the environment of foam cells is particularly complex and difficult to reproduce in vitro. Indeed, these cells are exposed to a variety of oxidized/modified lipoproteins, subject to massive cytokine stimulation and can be exposed to low oxygen tension. This latest, also called hypoxia, is an environmental condition well known to modulate different cellular mechanisms such as lipid storage, inflammation and death processes. If the effects of hypoxia on tumor cells are well studied, the effects of hypoxia on foam cells in atherosclerosis are still largely unknown. The aim of our work is to compare the effects of two different types of oxidized LDL on lipid load, on unfolded protein response (UPR) and on death processes in macrophages-derived foam cells as well as to study the effects of hypoxia on these mechanisms. In this work we used two different types of oxidized/modified LDL to generate foam cells out of THP-1 derived macrophages. As the physiological relevance of the traditional copper sulphate oxidized LDL is still a matter of debate it is of interest to settle new experimental models. Hence, in parallel to copper sulphate oxidized LDL or Ox-LDL, we used LDL oxidized with myeloperoxidase (MPO), a peroxidase found to be present and active in atheroma. In contrast to Ox-LDL which are oxidized both on lipidic and proteic moieties, the LDL oxidized by MPO called Mox-LDL, are only modified on apoB. In the first part, we established the experimental conditions giving rise to a marked foam cell phenotype with both types of LDL. We determined that a 72 hours incubation in the presence of 100 µg/ml with Ox-LDL or Mox-LDL led to heavily loaded cells. The cells incubated in the presence of Mox-LDL displayed a larger lipid load than the cells incubated with the same concentration of Ox-LDL for the same period of time. Then, we studied the effect of hypoxia on lipid load of cell incubated with Ox-LDL or Mox-LDL. The incubation of macrophages with Ox-LDL or Mox-LDL under hypoxia (1 % O2) did not influence the lipid load. In the second part, stress-induced pathways were investigated. Both Ox-LDL and Mox-LDL triggered the UPR, but in a different way. While the cells incubated for 72 hours in the presence of Ox-LDL displayed pronounced UPR with marked eIF2α phosphorylation and pronounced XBP-1 splicing, the cells incubated for 72 hours in the presence of Mox-LDL presented low level eIF2α phosphorylation and moderate XBP-1 splicing. The cells incubated with these two types of LDL under hypoxia showed less pronounced markers of UPR, suggesting a protective effect of this environmental condition. We also showed that both types of LDL were cytotoxic after 72 hours of incubation, the Mox-LDL to a larger extent than the Ox-LDL. Cells incubated in the presence of Ox-LDL and to a larger extent with Mox-LDL, showed markers of apoptosis (PARP cleavage, α-fodrin cleavage, caspases 3 and 7 cleavage). With both types of LDL, the amount of apoptotic markers was decreased when the cells were incubated under hypoxia, again suggesting a protective effect of low oxygen tension. As we evidenced that hypoxia induced the overexpression of different chaperones, such as Grp78, Grp94 and ERO1, we hypothesized that the protection provided by hypoxia partly depended on these proteins. The autophagy which is described to be triggered by ER stress such as UPR was finally studied. We evidenced that the cells incubated with both types of oxidized LDL displayed increased features of macroautophagy, without influence of hypoxia. We hypothesized that even if Ox-LDL and Mox-LDL triggered autophagy, the purpose of the process is different for each type of LDL. While autophagy would be protective and would prevent apoptosis in the cells incubated in the presence of Ox-LDL, it may be lethal and act in synergy with apoptosis to induce cell death in the cells incubated in the presence of Mox-LDL. Altogether, these results show that foam cells can be obtained with macrophage incubation with different types of oxidized LDL. However, the foam cells obtained with the different oxidized LDL displayed different stress associated signaling pathways. To unravel these different signaling pathways as well as to understand the effects of hypoxia on these signaling pathways in foam cell is important to design and improve future therapeutic strategies.

(fre) A l’origine des manifestations cliniques létales des plaques athéromateuses figure souvent le phénomène de rupture. Celui-ci est favorisé par la mort de macrophages spumeux, phénomène qui engendre aussi la formation du cœur nécrotique. Le contexte dans lequel les cellules spumeuses meurent est particulièrement complexe. Il implique la présence de particules lipoprotéiques oxydées et/ou modifiées de diverses manières, un contexte inflammatoire intense ainsi que de l’hypoxie. Les effets de cette condition environnementale sont multiples et incluent notamment la modulation de la réponse inflammatoire et des phénomènes de mort ainsi que des effets sur la charge lipidique. Si l’hypoxie est bien étudiée dans le contexte des tumeurs, ses effets sur les macrophages dans l’athérosclérose sont peu compris. Durant ce travail, nous avons d’abord mis au point un modèle expérimental permettant l’acquisition d’un phénotype spumeux par l’utilisation de deux types de LDL oxydées/modifiées. Nous avons ensuite étudié en parallèle la réponse UPR et les phénomènes de mort cellulaire dans les cellules spumeuses générées avec chaque type de LDL, ainsi que les effets de l’hypoxie sur ces processus. La question de la relevance physiologique des traditionnelles LDL oxydées au sulfate de cuivre étant toujours en suspens, il est judicieux d’avoir à notre disposition d’autres modèles pour l’étude de la pathologie de l’athérosclérose. C’est pourquoi nous avons utilisé deux types de LDL oxydées/modifiées pour transformer en cellules spumeuses des macrophages différenciés à partir de THP-1. En plus des LDL traditionnelles oxydées au sulfate de cuivre ou Ox-LDL, nous avons utilisé des LDL oxydées par la myéloperoxydase (MPO) ou Mox-LDL. Contrairement aux Ox-LDL qui présentent des oxydations sur la fraction lipidique et protéique, les Mox-LDL sont uniquement modifiées sur la fraction protéique des particules, et ce, essentiellement par l’HOCl produit par la MPO. Bien que ces LDL soient encore peu répandues, de nombreux arguments indiquent que la MPO est un candidat sérieux aux processus de modification des LDL in vivo. Nous avons donc défini les conditions d’obtention d’un phénotype spumeux avec les deux types de LDL oxydées/modifiées. Ces conditions sont une incubation de 72 heures en présence de 100 µg/ml de LDL et permettent l’obtention d’une charge lipidique prononcée avec les deux types de LDL. Nous avons constaté qu’à concentration égale et sur la même durée d’incubation, les Mox-LDL induisent une charge lipidique plus prononcée que les Ox-LDL. Nous avons montré que l’incubation de macrophages en présence de différents types de LDL oxydées/modifiées sous hypoxie (1 % O2) n’influence pas la charge lipidique. En étudiant la réponse UPR, nous avons constaté que les Ox-LDL et les Mox-LDL étaient toutes deux capables d’induire cette réponse. Cependant, les deux types de LDL n’induisent pas une réponse équivalente. Alors qu’après 72 heures d’incubation en présence de Ox-LDL les cellules présentent une réponse UPR prononcée avec une phosphorylation d’eIF2α abondante et une quantité accrue du messager de XBP-1S, les cellules incubées 72 heures en présence de Mox-LDL ne présentent qu’une faible phosphorylation d’eIF2α et un accroissement moindre de l’abondance du messager de XBP-1S. Les cellules incubées en présence de ces deux types de LDL en hypoxie présentent des marqueurs de la réponse UPR moins prononcés, ce qui suggère un effet protecteur de l’hypoxie. Nous avons ensuite montré que les Ox-LDL et les Mox-LDL sont toutes deux toxiques et induisent la mort des macrophages par apoptose. Cependant, alors que les Ox-LDL n’induisent qu’un faible niveau d’apoptose, les Mox-LDL induisent un niveau élevé. Les cellules incubées en présence de Ox-LDL et de Mox-LDL sous hypoxie présentent des marqueurs d’apoptose fortement réduits par rapport aux cellules incubées en normoxie, ce qui confirme l’hypothèse d’un effet protecteur de cette condition environnementale. La protection apportée par l’hypoxie pourrait être due à une surexpression de diverses chaperonnes aux effets protecteurs (Grp78, Grp94 et ERO1) induite par l’hypoxie. L’étude de l’autophagie, connue pour pouvoir être déclenchée par les stress du RE, a ensuite révélé que les cellules incubées en présence des deux types de LDL présentent des signes d’une autophagie accrue en normoxie aussi bien qu’en hypoxie. Nous émettons l’hypothèse que l’origine et la fonction de l’autophagie dans les cellules incubées en présence de Ox-LDL et en présence de Mox-LDL seraient différentes. Alors que l’autophagie déclenchée dans les cellules incubées en présence de Ox-LDL s’avèrerait protectrice et limiterait le phénomène d’apoptose, celle déclenchée dans les cellules incubées en présence de Mox-LDL s’avèrerait délétère et agirait en synergie avec l’apoptose pour induire la mort des cellules. L’ensemble de ces données montre que des cellules spumeuses peuvent être obtenues par l’incubation de macrophages en présence de différents types de LDL oxydées/modifiées. Les réponses aux stress et les voies de signalisation dans ces cellules spumeuses générées avec différents types de LDL oxydées/modifiées sont toutefois différentes. Par ailleurs, nous avons également montré que l’hypoxie pouvait avoir un impact considérable sur ces réponses, comme l’inhibition de l’apoptose par exemple. L’étude de ces différentes voies de signalisation induites en réponse à différents types de LDL oxydées/modifiées ainsi que les effets de l’hypoxie sur celles-ci est importante pour l’élaboration et l’amélioration des futures approches thérapeutiques.