Identification et caractérisation immunologique d'antigènes spécifiques de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis à des fins vaccinales.

(eng) Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, the etiological agent of chronic enteritis of the small intestine in domestic and wild ruminants, causes substantial losses to livestock industry. Control of this disease is seriously hampered by the lack of adequate diagnostic tools and vaccines. The first generation vaccines, composed of whole mycobacteria (killed or live-attenuated) in oily adjuvant confer a partial protection, by delaying the excretion of the mycobacteria in the faeces and by reducing the number of animals progressing to the clinical phase. However, they interfere with the diagnostic test of bovine tuberculosis making their use in cattle problematic. It is important to develop a new generation of vaccines which will protect better from the infection and which will not interfere with the screening tests of tuberculosis and paratuberculosis. M. paratuberculosis is a slowly growing mycobacterial species, requiring 6 to 8 weeks of culture before colonies can be counted visually. This particularity hampers infection, immunity and vaccination studies. In order to facilitate the screening of new vaccine candidates we have developed a luminescent M. paratuberculosis expressing luxAB genes of Vibrio harveyi and we have described its use for vaccine testing in an experimental mouse model, replacing fastidious and costly enumeration of CFU on agar by easy and rapid luminometry. Using this luminescent isolate, we have re-evaluated the effect of murine Slc11a1 (formerly called Nramp1) polymorphism on susceptibility to M. paratuberculosis. A series of inbred mouse strains were infected intravenously with luminescent M. paratuberculosis S-23 and monitored for bacterial replication in spleen, liver, and lungs for 12 weeks. The results confirm that, as for M. avium, innate resistance to infection is genetically controlled by Slc11a1. In BALB/c H-2d, congenic BALB.B10 H-2b (BALB/c background; H-2b), C57BL/6 H-2b, and beige C57BL/6bg/bg mice (all four homozygous for the susceptible Slc11a1s allele) bacterial numbers in spleen and liver remained unchanged during the first 4 weeks of infection. In DBA/2 and congenic BALB/c.DBA/2 (C.D2) mice (both homozygous for the resistant Slc11a1r allele) and in (C57BL/6 x DBA/2)F1 mice (heterozygous Slc11a1s/r), bacterial numbers decreased more than 10-fold during the first 4 weeks of infection in both male and female mice. At later time points, additional differences in bacterial replication were observed between the susceptible mouse strains, particularly in the liver. Whereas bacterial numbers in the liver gradually decreased more than 100-fold in C57BL/6 mice between week 4 and week 12, bacterial numbers were stable in livers from BALB/c and beige C57BL/6bg/bg mice during this period. Mycobacterium-specific gamma interferon responses developed earlier and to a higher magnitude in C57BL/6 mice than in BALB/c mice and were lowest in resistant C.D2 mice. In our screening of new vaccine candidates, we evaluated the immunogenicity and the protective potential of ten M. paratuberculosis specific proteins identified by two differents approaches. The first consisted in the systematic proteomic identification of proteins present in M. paratuberculosis culture filtrate (CF), followed by the selection of M. paratuberculosis-specific proteins by BLAST query on available mycobacterial genome and in the immunoproteomic analysis of both M. paratuberculosis extract and CF, using sera from M. paratuberculosis-infected and M. bovis-infected cattle. The second “in silico” approach consisted of the comparison of M. paratuberculosis sequences with all mycobacterial genomes and only sequences which not have homology were selected. A third selection was carried out using three different T cell epitope prediction programs, ‘‘Tsites’’, ‘‘BIMAS’’ and ‘‘SYFPEITHI’’, in order to select the most promising antigenic sequences, with respect to future vaccine development. The ten candidates selected were MAP0586c, MAP4308c, MAP1693c, Ag3 (CF036), MAP2677c, (identified by post-genomic and immuno-proteomic analysis of M. paratuberculosis secretome) and Ag5, Ag6, MAP1637c, MAP0388 and MAP3743 (identified by bioinformatic in silico screening of the M. paratuberculosis genome). Each antigen was cloned into the eukaryotic expression vector V1.Jns-tPA and plasmids were used to vaccinate BALB/c and C57BL/6. Plasmid DNA vaccination is a powerful and easy tool for the high throughput screening of the vaccine potential of protein antigens and DNA vaccines are particularly promising for the prevention of infections caused by intracellular pathogens, precisely because of the ease with which they induce strong Th1 biased cellular immune responses without the use of additional adjuvants. Each candidate was also cloned into the prokaryotic expression vector pQE-80L and purified as hexa-histidine taggedrecombinant protein by Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC). Strong, antigen-specific IFN- and IL-2 responses were induced in mice vaccinated with plasmid DNA encoding MAP0586c, MAP4308c, MAP1693c, MAP1637c, MAP0388 and MAP3743. In contrast, T cell responses in M. paratuberculosis infected mice were directed preferentially against MAP0586c and Ag5 and to a lesser extent against MAP3743. Interestingly, vaccination with plasmid DNA encoding MAP0586c induced only very weak levels of IgG1 antibodies in C57BL/6 and BALB/c mice. Vaccination with DNA coding for MAP4308c, MAP1693c and MAP2677c stimulated the production of antibodies in both strains of mice. DNA vaccinated BALB/c mice showed also lower antibody responses against three in silico identified antigens i.e. Ag5, Ag6 and MAP1637c. Finally, one of the tested DNA vaccines, i.e. DNA vaccine encoding MAP0586c, the putative trasnglycocylase, could protect BALB/c mice against subsequent challenge with luminescent M. paratuberculosis to the same extent as the Mycobacterium bovis BCG vaccine, indicating that this protein is an interesting vaccine candidate that warrants further investigation.

(fre) Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, l’agent étiologique de l'entérite chronique de l'intestin grêle chez les ruminants domestiques et sauvages, cause d’importantes pertes à l'industrie de bétail. Le contrôle de cette maladie est sérieusement entravé par le manque d'outils de diagnostic et de vaccins appropriés. Les vaccins de la première génération, constitués par des combinaisons de mycobactéries entières (tuées ou vivantes-atténuées) en adjuvant huileux confèrent une protection partielle, en retardant l'excrétion des mycobactéries dans les fèces et en réduisant le nombre d'animaux dans la phase clinique. Toutefois, ils interfèrent dans le test de diagnostic de la tuberculose bovine ce qui rend impossible leur utilisation chez le bovin. Il est important de développer des vaccins de nouvelle génération qui protégeront mieux de l'infection et qui n'interféreront pas avec les tests de dépistage de la tuberculose et de la paratuberculose. M. paratuberculosis appartient au groupe des mycobactéries à croissance lente, ayant besoin de 6 à 8 semaines de culture avant de pouvoir visualiser les colonies sur un milieu solide. Cette particularité est un frein aux études d’infection, d’immunologie et de vaccination. Afin de faciliter l’étude de nouveaux vaccins, nous avons développé une souche de M. paratuberculosis luminescent exprimant les gènes de luxAB de Vibrio harveyi et nous avons décrit son utilisation lors d’un essai de vaccination dans un modèle expérimental murin, remplaçant ainsi l’énumération fastidieuse et coûteuse des CFU par la technique de luminométrie très rapide et facile. En utilisant cette souche luminescente, nous avons ainsi réévalué l'effet du polymorphisme du gène murin Slc11a1 (anciennement appelé Nramp1) sur la susceptibilité à M. paratuberculosis. Une série de souris consanguines (« inbred ») ont été infectées par voie intraveineuse avec la souche de M. paratuberculosis S-23 luminescente et la charge bactérienne dans la rate, le foie, et les poumons de chaque animal a été suivie pendant 12 semaines. Les résultats confirment que, comme pour M. avium, la résistance innée à l'infection est génétiquement contrôlée par le gène Slc11a1. Chez les souris BALB/cH-2d, les souris congéniques BALB.B10 H-2b (fond génétique des BALB/c ; H-2b), les souris C57BL/6 H-2b, et les souris beiges C57BL/6bg/bg (tous Slc11a1s) le nombre de bactéries dans la rate et le foie n’a pas changé lors des 4 premières semaines de l'infection. Chez les souris DBA/2, les souris congéniques BALB/c.DBA/2 (C.D2) (homozygotes pour l’allèle de résistance Slc11a1r) et les souris (C57BL/6 x DBA/2)F1 (hétérozygotes, Slc11a1s/r), le nombre de bactéries a diminué plus de 10 fois à 4 semaines post-infection aussi bien chez les souris mâles que chez les souris femelles. A des temps plus tardifs, des différences supplémentaires ont été observées dans la réplication bactérienne entre les lignées de souris susceptibles et plus particulièrement dans le foie. Alors que la charge bactérienne diminuait plus de 100 fois chez les souris C57BL/6 entre 4ème et la 12ème semaine, le nombre de bactéries restait stable dans le foie des souris BALB/c et des souris beiges C57BL/6bg/bg. La production spécifique d’IFN-γ s’est développée plus tôt et plus fortement chez les souris C57BL/6 comparée à celle observée chez les souris BALB/c et elle était la plus faible chez les souris C.D2, résistantes à l’infection. Dans notre recherche de nouveaux candidats, nous avons évalué l'immunogénicité et le potentiel vaccinal de dix protéines spécifiques de M. paratuberculosis, identifiés par deux différentes approches. La première a consisté en l'identification systématique des protéines du filtrat de culture de M. paratuberculosis, suivie par la sélection des protéines spécifiques par le programme BLAST sur les génomes mycobactériens disponibles et à une analyse immuno-protéomique des protéines du filtrat de culture et d’extrait de M. paratuberculosis en utilisant des sérums de bovins infectés par M. paratuberculosis et par M. bovis. La troisème approche « in silico » a consisté en la sélection de séquences spécifiques de M. paratuberculosis par comparaison avec l’ensemble des génomes mycobactériens disponibles et, seules les séquences n’ayant pas d’homologies significatives ont été sélectionnées. Enfin, une dernière sélection a été effectuée en utilisant trois programmes de prédiction d'épitope pouvant être présentés aux cellules T : « Tsites », « BIMAS » et « SYFPEITHI » afin de choisir les séquences prédites les plus immunogéniques pour le développement d’un futur vaccin. Les dix candidats choisis étaient MAP0586c, MAP4308c, MAP1693c, Ag3 (CF036), MAP2677c, (identifiés par l’analyse protéomique et immuno-protéomique) et l’Ag5, Ag6, MAP1637c, MAP0388 et MAP3743 (identifiés par l’analyse « in silico »). Chaque antigène a été cloné dans le vecteur d’expression eucaryote V1.Jns-tPA et les plasmides ont été utilisés pour vacciner des souris BALB/c et C57BL/6. La vaccination à ADN plasmidique est un outil puissant et facile par sa capacité de cribler à haut débit le potentiel vaccinal d’antigènes protéiques. De plus, les vaccins à ADN plasmidiques sont particulièrement prometteurs pour la prévention des infections provoquées par les agents pathogènes intracellulaires, grâce à leur capacité à induire de fortes réponses immunes de type cellulaire Th1 sans l’utilisation supplémentaire d’adjuvants. D’autre part, chaque candidat a aussi été cloné dans le vecteur d’expression procaryote pQE-80L afin de purifier les 10 protéines recombinantes contenant une queue hexa-histidine en position amino-terminale NH2 par une chromatographie d'affinité d’ions métalliques immobilisés (IMAC). De fortes réponses spécifiques d'IFN-γ et d’IL-2 ont été induites chez les souris vaccinées par les ADN plasmidiques codant pour MAP0586c, MAP4308c, MAP1693c, MAP1637c, MAP0388 et MAP3743. En contraste, les réponses T induites chez les souris infectées par M. paratuberculosis ont été dirigées préférentiellement contre MAP0586c et Ag5 et dans une moindre mesure contre MAP3743. La vaccination avec l’ADN plasmidique codant pour MAP0586c induisait un très faible niveau d’anticorps IgG1 chez les souris C57BL/6 et BALB/c. La vaccination avec les ADN plasmidiques codant pour MAP4308c, MAP1693c et MAP2677c stimulait la production d’anticorps chez les deux lignées de souris. Les souris BALB/c vaccinées présentaient aussi de plus faibles niveaux d’anticorps contre trois protéines identifiées i.e. Ag5, Ag6 et MAP1637c. En conclusion, un des vaccins à ADN plasmidique, i.e. celui codant pour MAP0586c, une possible transglycosylase, a conféré une protection chez les souris BALB/ contre une infection avec M. paratuberculosis et ceci avec la même performance que le vaccin Mycobacterium bovis BCG, indiquant que ce candidat vaccinal est intéressant et qu’il nécessite de futures investigations.