Effets du donneur de peroxynitrite, la 3-morpholinosydnonimine, sur les cellules endothéliales. Rôle du facteur de transcription Nrf2 et de la voie UPR.

(eng) In physiological conditions, endothelial cells produce superoxide anions (O2•-) and nitric oxide (NO). O2•- are precursors, among others, of hydrogen peroxide, involved in signaling processes leading to the regulation of gene expression. At higher concentrations, hydrogen peroxide promotes the formation of the cytotoxic hydroxyl radicals. NO, in turn, exerts well-recognized beneficial effects on the cardiovascular system by inducing in particular the relaxation of smooth muscle cells. But when the NO concentration becomes too high, it competes with superoxide dismutases and reacts with O2•- to form peroxynitrite. The latter is a highly reactive molecule, attacking fatty acids, nucleic acids and proteins (with the formation of, for instance, 3-nitrotyrosine) and involved in endothelial dysfunction, a phenomenon at the basis of cardiovascular diseases. Reactive oxygen or nitrogen species can therefore, depending on the conditions, act as second messengers at low concentrations or as toxic molecules inducing oxidative stress at higher concentrations. Under normal conditions, the production of peroxynitrite is low and the damage that it could cause is limited by various defense systems, such as the Nrf2 (nuclear transcription factor erythroid 2p45 - related factor) and the UPR pathways (Unfolded Protein Response). Nrf2 is a transcription factor that responds to oxidative stress and regulates the expression of genes encoding detoxifying or antioxidant proteins such as heme oxygenase-1 (HO-1) or NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1). The UPR is an intracellular signaling pathway activated by the accumulation of misfolded proteins in the endoplasmic reticulum leading to the activation of various proteins such as the PERK kinase and the ATF6 transcription factor. The UPR aims to increase the synthesis of chaperonnes including BiP and GRP94, and thus increase the cellular capacity to fold or eliminate misfolded proteins. However, if the stress is too intense or too long, the UPR can induce cell death by apoptosis in particular via the activation of the transcription factor CHOP (CAAT/ enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein). The objective of this thesis was to better understand the effects of peroxynitrite on endothelial cells, by discriminating, on one hand, its role as second messenger triggering defense responses to stress and, on the other hand, its toxicity leading to apoptosis. To achieve this goal, we chose an experimental system for peroxynitrite formation, SIN-1 (3-morpholinosydnonimine). We also tried to develop "more physiological" systems of peroxynitrite generation in vitro. Among the systems described to generate peroxynitrite, we chose homocysteine, hypoxia/reoxygenation, oxidized LDL and angiotensin-II. In this study, we developped an experimental model of endothelial cell exposure to peroxynitrite by incubating human endothelial cells in culture (the EAhy926 cell line and the primary culture, HUVEC) in the presence of SIN-1. Firstly, we tested the cytotoxicity of SIN-1 and we characterized the peroxynitrite formation induced by SIN-1 in these cellular models by following the oxidation of the hydroxyphenyl fluorescein probe and the formation of 3-nitrotyrosine by Western blot with anti-3-NT antibodies. Secondly, we demonstrated the activation of the Nrf2 and UPR pathways by SIN-1. We also showed that SIN-1 was able to exert a protective effect in serum-starved EAhy926 cells. By investigating some of the molecular mechanisms involved in the cytoprotective effect of SIN-1, we found that, via Nrf2 and HO-1 proteins, SIN-1 induced a decrease in DNA fragmentation and increased LC3-II formation in serum-starved endothelial cells. We also evaluated the effects of more physiological conditions (homocysteine, hypoxia/reoxygenation, oxidized LDL and angiotensin-II) on the peroxynitrite formation. It seems that the latter is generated in the presence of oxidized LDL and angiotensin-II combined with a NO donor. However, more investigations are necessary to further optimize some of these "more physiological" conditions on the peroxynitrite formation and to confirm the cytoprotective effect of peroxynitrite observed in serum-starved endothelial cells exposed to SIN-1. Altogether, our results indicate that in a narrow range of concentration, peroxynitrite formed after SIN-1 stimulation, activates the Nrf2 and UPR pathways, leading to a cytoprotective effect in serum-starved endothelial cells. This protective effect is achieved by stimulating the endothelial cells either after or before a period of serum starvation. The latter is in agreement with so called conditioning experiments in vivo. This work provides some new insights in the balance between survival signals or cell death triggered by peroxynitrite and highlights under which conditions this balance leads to endothelial cell death, in the context of endothelial dysfunction, involved in the early stages of atherosclerosis. It also suggests that a drastic anti-oxidant therapy targetting cardiovascular diseases could have drawbacks, as it abolishes the positive effects of reactive oxygen and nitrogen species.

(fre) En conditions physiologiques, les cellules endothéliales produisent des anions superoxyde (O2•-) et du monoxyde d’azote (NO). Les O2•- sont des précurseurs, entre autres, du peroxyde d’hydrogène, impliqué dans des processus de signalisation aboutissant à des régulations d’expression génique. A plus forte concentration, le peroxyde d’hydrogène favorise la formation de radicaux hydroxyl, cytotoxiques. Le NO, quant à lui, a une action bénéfique reconnue sur le système cardiovasculaire en induisant notamment la relaxation des cellules musculaires lisses. Mais lorsque la concentration en NO est trop importante, il entre en compétition avec les superoxyde dismutases et réagit avec les O2•- pour former le peroxynitrite. Ce dernier est une molécule hautement réactionnelle, réagissant avec les acides gras, les acides nucléiques et les protéines (avec par exemple, la formation de 3-nitrotyrosines) et impliquée dans le dysfonctionnement endothélial, phénomène à la base des maladies cardiovasculaires. Les espèces réactives de l’oxygène ou de l’azote peuvent donc, selon les conditions, jouer un rôle de messagers secondaires à faible concentration ou de molécules toxiques induisant un stress oxydatif à plus forte concentration. En conditions normales, la production de peroxynitrite est faible et les dommages qu’il pourrait induire sont limités par divers systèmes de défense. Parmi ces moyens de défense, il y a la voie du facteur de transcription Nrf2 (« nuclear transcription factor erythroid 2p45 – related factor ») et la voie UPR (« Unfolded Protein Response »). Nrf2 est un facteur de transcription qui répond aux stress oxydatifs et régule l’expression des gènes codant pour des protéines anti-oxydantes ou détoxifiantes telles que l’hème oxygénase-1 (HO-1) ou la NAD(P)H quinone oxydoréductase 1 (NQO1). La voie UPR est une voie de signalisation intracellulaire cytoprotectrice activée par l’accumulation de protéines mal repliées dans le réticulum endoplasmique aboutissant à l’activation de divers acteurs moléculaires dont la kinase PERK et le facteur de transcription ATF6. La voie UPR a pour but d’augmenter la synthèse des chaperonnes dont BiP et Grp94, et ainsi d’augmenter la capacité de bien replier et d’éliminer les protéines mal repliées. Cependant, si le stress est trop intense ou de trop longue durée, la voie UPR peut induire la mort cellulaire par apoptose notamment via le facteur de transcription CHOP (« CAAT/Enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein »). L’objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre les effets du peroxynitrite dans les cellules endothéliales, en discriminant d’une part sa fonction de messager secondaire déclenchant des réponses de défense au stress, et d’autre part, sa toxicité pouvant mener à l’apoptose. Pour ce faire, nous avons choisi un système expérimental de formation de peroxynitrite, le SIN-1 (3-morpholinosydnonimine). Nous avons aussi essayé de mettre au point différents systèmes dits « plus physiologiques » de génération de peroxynitrite in vitro. Parmi les systèmes décrits pour générer du peroxynitrite, nous avons choisi l’homocystéine, l’hypoxie/réoxygénation, les LDL oxydées et l’angiotensine-II. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle expérimental d’exposition des cellules endothéliales au peroxynitrite en incubant des cellules endothéliales humaines en culture (lignée EAhy926 et cellules en primo-culture HUVEC) en présence de SIN-1. Dans un premier temps, nous avons testé la cytotoxicité du SIN-1 et nous avons caractérisé la formation de peroxynitrite à partir de SIN-1 dans ces modèles cellulaires en suivant l’oxydation de la sonde hydroxyphényl fluorescéine et la formation de 3-nitrotyrosines par une analyse en Western blot avec des anticorps dirigés contre les 3-nitrotyrosines. Dans un second temps, nous avons mis en évidence l’activation de la voie Nrf2 et de la voie UPR par le SIN-1 et nous avons démontré que le SIN-1 exerce un effet protecteur dans les cellules EAhy926 soumises à une privation de sérum. En décortiquant les mécanismes moléculaires impliqués dans l’effet cytoprotecteur du SIN-1, nous avons constaté que, via les protéines Nrf2 et HO-1, le SIN-1 induit une diminution de la fragmentation de l’ADN et une augmentation de la formation de LC3-II dans les cellules endothéliales soumises à une privation de sérum. Au cours de ce travail, nous avons également évalué l’effet de conditions particulières (homocystéine, hypoxie/réoxygénation, LDL oxydées et angiotensine-II) sur la formation de peroxynitrite. Il semblerait que ce dernier soit généré en présence de LDL oxydées et d’angiotensine-II combinée à un donneur de NO. Toutefois, de plus amples investigations sont encore nécessaires afin de pouvoir optimaliser ces conditions dites « plus physiologiques » sur la formation de peroxynitrite et confirmer l’effet cytoprotecteur du peroxynitrite observé dans des cellules endothéliales soumises à une privation de sérum et exposées au SIN-1. Les résultats obtenus au cours de ce travail montrent donc que, dans une gamme de concentration étroite, le peroxynitrite formé suite à la stimulation des cellules endothéliales avec le SIN-1, permet de les protéger contre la toxicité induite par une privation de sérum, que la stimulation avec le SIN-1 soit réalisée après ou avant la privation de sérum, cette dernière condition se rapprochant des expériences dites de conditionnement in vivo. Ce travail nous a donc permis de mieux comprendre l’équilibre entre les signaux de survie ou de mort cellulaires déclenchés par le peroxynitrite et de préciser dans quelles conditions cet équilibre bascule vers la mort des cellules endothéliales, dans le contexte du dysfonctionnement endothélial, impliqué dans les étapes précoces de l'athérosclérose. Il suggère également qu’une thérapie anti-oxydante trop drastique des maladies cardiovasculaires risque de supprimer les actions positives des espèces réactives de l’oxygène et des espèces réactives de l’azote présents en faible concentration.