Dandoy, Damien
[UCL]
(eng)
The transposon Tn4430 from Bacillus thuringiensis encodes a DNA site-specific recombination system (TnpI/IRS system) that functions to resolve cointegrate intermediates arising from replicative transposition. The IRS site-specific recombination site contains four DNA binding motifs for the recombinase TnpI. The IR1 and IR2 motifs form the recombination core site at which TnpI acts to cleave and rejoin the DNA strands. The DR1 and DR2 motifs are accessory sequences whose function is to control and stimulate the resolution of cointegrates by restricting recombination to sites that are present on a same DNA molecule. This control takes place by the formation of a synaptic complex with a specific architecture, in which the DNA is intertwined around the recombinases with a specific topology.
In this study, complementary biochemical approaches were developed to determine the role of the TnpI/IRS accessory sequences and proteins in the control of the recombination reaction and the molecular organisation of the recombination complex.
In the first part of the work, the topological architecture of the TnpI/IRS synaptic complex was investigated using two independent approaches. The results obtained with both approaches converge to a model for the topological architecture of the synaptic complex in which the DNA is wrapped around the TnpI protein, trapping 3 negative supercoils form the initial substrate.
In the second part of the thesis, the molecular steps leading to the assembly of the recombination complex and its structure organisation were investigated in further detail
Together, the data support a dynamic model for the assembly of TnpI/IRS recombination complex, in which formation of a synapse between the accessory sequences of the partners acts as a checkpoint for controlling the outcome of the recombination reaction. The molecular organisation of the complex was also modelled based on our results and structural data available in the literature. This model was validated by examining the recombination activity of specific IRS variants.
(fre)
Le transposon Tn4430 de Bacillus thuringiensis encode un système de recombinaison site-spécifique (système TnpI/IRS) dont la fonction est de résoudre les cointégrats générés par son mode de transposition réplicatif. Le site de recombinaison IRS (116 pb) contient quatre motifs de fixation pour la recombinase TnpI. Les deux premiers motifs, IR1 et IR2, constituent le site cœur de recombinaison au niveau duquel les recombinases catalysent les réactions de coupure et d’échange de brins. Les deux autres motifs, DR1 et DR2, présents en aval du site cœur sont des sites accessoires dont la fonction est de contrôler et stimuler la résolution du cointégrat en favorisant le rapprochement des deux sites cœurs présents en orientation directe sur la molécule d’ADN surenroulée (recombinaison intramoléculaire). Ce contrôle s’opère par la formation d’un complexe synaptique de géométrie déterminée au sein duquel l’ADN des deux IRS est enroulé autour des recombinases avec une topologie particulière. La formation d’un tel complexe produit, après échange des brins d’ADN, un caténat à deux croisements. En absence des sites accessoires les sous-unités liées aux sites cœurs présentent une activité « relâchée » produisant différents types de réarrangements inter- et intramoléculaires.
Dans ce travail de thèse, nous avons essayé comprendre le rôle joué par les séquences accessoires dans le contrôle de la réaction de recombinaison, et l’organisation moléculaire du complexe TnpI/IRS.
La première partie de ce travail a consisté à déterminer l’architecture topologique du complexe synaptique TnpI/IRS par deux méthodes indépendantes. Dans une première étape, des analyses topologiques ont été réalisées au moyen de sites de recombinaison hybrides composés par le système Cre/loxP du bactériophage P1 et les séquences accessoires du système TnpI/IRS. Dans une seconde approche, l’étude du complexe synaptique a été réalisée grâce à l’analyse de la topologie des produits de recombinaison obtenus sur un substrat particulier; des nœuds d’ADN (DNA knots) possédant deux copies de l’IRS. Les résultats obtenus par ces deux méthodes convergent vers un modèle de complexe synaptique dans lequel trois croisements de sur-enroulements sont emprisonnés au niveau des sites accessoires DR1 et DR2 de l’IRS.
Dans la deuxième partie de ce travail nous avons déterminé avec plus de précision les différentes étapes de l’assemblage du complexe TnpI/IRS ainsi que son organisation moléculaire. Des expériences de retard sur gel réalisées entre la recombinase TnpI et l’IRS ont mis en évidence la formation successive de quatre complexes retardés. L’identité de ces complexes retardés a été déterminée grâce à des expériences de « footprint » in gel ainsi que par des expériences de retard sur gel réalisées avec différents variants de l’IRS. Ces expériences ont montré que la recombinase TnpI se lie préférentiellement aux deux motifs accessoires DR1-DR2 avant de se lier aux sites cœurs IR1-IR2. L’organisation moléculaire du complexe de recombinaison a ensuite été investiguée en déterminant les déformations induites par la liaison de la TnpI sur les différentes régions de l’IRS. Les différentes étapes d’assemblage du complexe ont également été visualisées par microscopie à force atomique.
Ensemble, nos résultats permettent de proposer un scénario hiérarchisé et dynamique pour l’assemblage du complexe de recombinaison TnpI/IRS. Dans ce scénario, la formation d’un complexe synaptique entre les molécules TnpI liées aux séquences accessoires de l’IRS joue un rôle pivot, qui permet de contrôler le rapprochement subséquent des sites cœurs et donc la catalyse de la réaction de recombinaison. Un modèle moléculaire a également été établi pour les différentes étapes d’assemblage et l’organisation finale du complexe. Ce modèle a été validé en comparant l’activité de recombinaison de différentes versions mutées de l’IRS.
Bibliographic reference |
Dandoy, Damien. Structure topologique et moléculaire du complexe de recombinaison site-spécifique TnpI/IRS du transposon Tn4430. Prom. : Hallet, Bernard |
Permanent URL |
http://hdl.handle.net/2078.1/33477 |