Caractérisation des profils d'expression génique de monocytes - macrophages en culture en réponse à des stimuli pro- et anti-inflammatoires par l'utilisation d'un damier à ADN de faible densité / Characterization of the gene expression profiles of cultured monocytes - macrophages in response to pro- and anti-inflammatory stimuli using a low density microarray

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par l'accumulation excessive de cholestérol au sein des artères de gros et moyen calibres. Suite à un dysfonctionnement endothélial, les monocytes circulants vont être recrutés au niveau de l'intima où ils vont se différencier en macrophages. Ceux-ci vont contribuer à maintenir un contexte pro-inflammatoire par la libération de médiateurs de l'inflammation tels que les leucotriènes, des espèces réactives de l'oxygène ou encore des cytokines. Parallèlement, les LDL (low density lipoprotein) vont diffuser au travers de la barrière endothéliale, et subir des modifications dans l'intima pauvre en anti-oxydants. Ces LDL modifiées vont être reconnues par les macrophages qui expriment des récepteurs dits "scavengers" et vont internaliser ces particules jusqu'à devenir des cellules spumeuses gorgées de graisse. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé un damier à ADN de faible densité, la DualChip' Inflammation pour étudier les effets de molécules et complexes supra-moléculaires sur le profil d'expression génique de monocytes et macrophages, humains et murins, en culture. Nous avons, dans un premier temps, participé à la validation de ce damier à ADN regroupant des sondes de capture correspondant à des gènes encodant des protéines impliquées dans les réponses inflammatoires. Nous avons stimulé des macrophages murins RAW264.7, 6 heures avec du LPS en présence ou non d'un inhibiteur de NF-kB, facteur de transcription clé des voies de transduction du signal en aval du TLR4, le récepteur au LPS. Typiquement, nous avons observé une surexpression de gènes encodant des cytokines, chémokines et facteurs de croissance, laquelle est partiellement inhibée par le BAY 11-7082, l'inhibiteur de NF-kB. Notre travail s'est alors scindé en deux grandes parties : une partie plus appliquée au cours de laquelle nous avons étudié les effets de cardénolides (stéroïdes cardiotoniques) et de LDL oxydées (au cuivre ou à la myéloperoxydase) sur le profil d'expression génique de monocytes / macrophages humains et murins, respectivement, et de cellules endothéliales humaines, dans le cas des LDL oxydées ; et une partie plus fondamentale dans laquelle nous avons étudié l'implication de la voie PI3K/Akt/mTOR dans des macrophages murins RAW264.7 stimulés au LPS. Pour cela, nous avons testé les effets des inhibiteurs chimiques de la voie NF-kB (BAY 11-7082), de la voie PI3K/Akt (LY294002 et wortmannine), et de la voie mTOR (rapamycine), sur les profils d'expression génique des macrophages stimulés avec du LPS. Suite à une analyse de classification ou "clustering" des données d'hybridation sur le damier à ADN DualChip® Mouse Inflammation, nous avons pu classer un sous-groupe de gènes régulés par le LPS en cinq clusters, différentiellement affectés par les inhibiteurs utilisés. Dans le cluster 5, le gène encodant la métalloprotéase matricielle MMP9 a retenu notre attention par son profil particulier. En effet, la rapamycine potentialise la surexpression de ce gène en réponse au LPS, tant au niveau des ARNm, qu'au niveau protéique. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents, nous avons investigué l'implication possible de différents acteurs des voies de transduction du signal activées par le LPS, et avons pu attribuer un rôle de régulateur négatif à mTOR dans le contrôle de l'expression du gène mmp9. Ces effets seraient médiés par une inhibition partielle des voies des MAPK ERK1/2 et p38, ainsi que par des effets de transrépression par PPAR?, un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires, aboutissant à une réduction de l'activité transactivatrice de NF-kB. Nos résultats mettent l'accent sur la complexité de la régulation de l'expression des gènes dans des macrophages stimulés avec du LPS, et sur l'importance de la spécificité des réponses pour un gène donné, mmp9 dans notre cas. Le LPS, composant bactérien, est un activateur puissant des cellules mammaliennes et en particulier des macrophages, et ce via des voies activatrices bien décrites maintenant, mais on découvre également de plus en plus que les cellules ont mis en place au cours de l'évolution, de nombreuses voies régulatrices négatives, et qui comme le montre ce travail, peuvent varier d'un gène à l'autre. Une connaissance plus globale, et des voies activatrices, et des voies inhibitrices dans le contexte de l'inflammation semble devoir s'imposer pour concevoir de nouvelles approches thérapeutiques potentielles.