Amélioration de la production de triterpènes par bio-ingénierie dans les trichomes chez Nicotiana tabacum

Les terpénoïdes constituent une des classes majeures des métabolites secondaires. Plus de 70 000 composés ont été identifiés dans l’ensemble du règne végétal et ont été répartis dans différentes classes : les monoterpènes (C10), les sesquiterpènes (C15), les diterpènes (C20), les triterpènes (C30), et les tétraterpènes (C40). Un pool de précurseurs regroupant l’isopentényl-diphosphate (IPP) et le diméthyllallyl-diphosphate (DMAPP) est à l’origine de la synthèse de l’ensemble de ces molécules. Ces précurseurs sont eux-mêmes issus de deux voies de biosynthèse distinctes, la voie du mévalonate (MVA) opérant dans le cytoplasme et la voie du méthylérythritol-phosphate (MEP) présente dans les chloroplastes. Certaines approches de bio-ingénierie se concentrent sur la production des triterpènes, composés intéressants pour l’Homme dans le cadre du développement de biocarburant ou pour leurs bienfaits pharmacologiques. L’originalité de cette démarche est l’utilisation d’organes spécialisés, les trichomes glandulaires, comme usines biochimiques pour produire une grande quantité de métabolites d’intérêt. En effet, les trichomes glandulaires de l’espèce Nicotiana tabacum (N. tabacum) produisent naturellement une grande quantité de diterpènes et donc de précurseurs de terpénoïdes. Ce pool peut ainsi être détourné pour produire les triterpènes d’intérêts. Ce mémoire poursuit donc l’objectif d’obtenir des plantes de N. tabacum produisant une grande quantité d’un triterpène spécifique dans leurs trichomes. Pour cela, la première démarche réalisée était le knockdown des voies de synthèse des deux diterpènes majoritaires, les labdanes et les cembranes, grâce à la technologie CRISPR-Cas9. Des plantes de N. tabacum transformées ont ainsi été obtenues et la technique d’analyse choisie, la chromatographie en phase gazeuse couplée avec un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID), a été optimisée. L’analyse du phénotype des plantes obtenues permettra de déterminer l’impact de l’inactivation de ces gènes sur la production des diterpènes. Le deuxième objectif était de modifier génétiquement les plantes de N. tabacum pour produire un acide triterpénique spécifique (acide oléanolique). La β-amyrine synthase produit de la β-amyrine à partir de l'oxydosqualène, le précurseur commun à tous les triterpènes. Le gène de la β-amyrine synthase (Atβas) a été cloné à partir d'ADNc d'Arabidopsis et exprimé de manière transitoire dans Nicotiana benthamiana pour vérifier sa localisation subcellulaire par microscopie confocale. Une expression transitoire de Mdαas et MdCYP450 marqués par GFP a également été réalisée. Les trois enzymes ont été localisées dans les reticulum endoplasmique, comme attendu. Enfin, une construction génétique comprenant la séquence codante d'Atβas en association avec celle de MdCYP450, toutes deux sous contrôle d'un promoteur spécifique du trichome, a été préparée et permettra la transformation des plantes de N. tabacum dans le but de produire une quantité significative d’acide oléanolique dans les trichomes. Terpenoids are one of the major classes of secondary metabolites. Currently, more than 70,000 compounds have been identified throughout the plant kingdom. These secondary metabolites are classified as: monoterpenes (C10), sesquiterpenes (C15), diterpenes (C20), triterpenes (C30), and tetraterpenes (C40). Isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP) are two of the precursors involved in the biosynthesis of terpenes. These precursors come from two distinct biosynthetic pathways, the mevalonate (MVA) pathway, operating in the cytoplasm, and the methylerythritol phosphate (MEP) pathway, occurring in the chloroplast. Bioengineering approaches focus on the production of triterpenes, which are of interest because of their use in biofuel development and their pharmacological effects. This approach introduces the use of specialized plant organs, glandular trichomes, as biochemical factories to produce a large quantity of secondary metabolites of interest. The glandular trichomes of Nicotiana tabacum (N. tabacum) naturally produce a large amount of diterpenes and therefore produce large pools of IPP/DMAPP. These pools could possibly be diverted to produce triterpenes of interest. In this project, we aimed at modifying N. tabacum plants to produce a large amount of some specific triterpenes in their trichomes. The first step we carried out was the knockdown of biosynthesis pathway of the two major diterpenes present in tobacco, labdanes and cembranes, using CRISPR-Cas9 technology. This resulted in genetically modified N. tabacum plants which were analysed using the GC-FID technology (Gas chromatography coupled with flame ionization detector). The protocol was optimised as part of the project. The analysis of the phenotype of these plants will allow to determine the impact of the inactivation of these genes on the production of diterpenes. The second objective was to genetically modify N. tabacum plants to produce a specific triterpenic acid (oleanolic acid). β-amyrin synthase produces β-amyrin from oxidosqualene, the common precursor to all triterpenes. The gene for β-amyrin synthase (Atβas) was cloned from Arabidopsis cDNA and transiently expressed in Nicotiana benthamiana to verify its subcellular localization by confocal microscopy. Transient expression of GFP-tagged Mdαas and MdCYP450 was also carried out. Finally, a genetic construct comprising the coding sequence of Atβas in association with the one of MdCYP450, both under control of a trichome-specific promoter, was prepared and will allow the transformation of N. tabacum plants in an attempt to produce significant amount of oleanolic acid in trichomes.