Validation des interactants d'HOXA5 dans le système nerveux central murin adulte

Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription très conservés au cours de l’évolution. Ils sont principalement connus pour leurs rôles durant l’embryogenèse, notamment dans l’établissement de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Cependant, ils sont également exprimés durant le stade post-natal et le stade adulte, notamment dans le cerveau où 24 gènes Hox sont exprimés après la naissance. Hoxa5 figure parmi ces gènes. Il est exprimé au niveau protéique dans plusieurs noyaux précérébelleux du pont et de la moelle allongée dans le cerveau murin adulte suivant un patron d’expression établi durant les stades tardifs du développement embryonnaire. Bien que cette expression laisse penser qu’ HOXA5 pourrait avoir de nouveaux rôles dans le cerveau après la naissance, ses fonctions et ses modes d’actions restent cependant à déterminer. Ce sont ces questions qui sont étudiées au sein du laboratoire de la Pr. Françoise Gofflot, et une des approches utilisées pour aborder ces problématiques est l’étude des interactions d’HOXA5. Une liste de candidats interactants d’HOXA5 dans le système nerveux central adulte a été établie sur bases des résultats d’une expérience de double hybride en levure et de l’utilisation de bases de données d’interactomique. Lors de ce mémoire, notre objectif était de valider les interactions contenues dans cette liste contenant 10 candidats interactants appartenant à différentes catégories fonctionnelles, notamment « Localisation subcellulaire » (IPO7, la protéine entière mais également, IPO7Cter, une protéine tronquée ne contenant pas la partie N-terminale d’IPO7, et PICK1), « Facteurs de transcription » (HOXA5, MEIS1, PBX1, PBX2, SMAD1,SOX2 et TWIST1), ainsi qu’une oxydoréductase (GLRX3). La réalisation d’hybridations in situ sur des coupes de cerveau de souris au stade post-natal et au stade adulte nous a permis de sélectionner les candidats exprimés dans les mêmes noyaux cérébraux qu’Hoxa5 afin de limiter notre étude aux seuls candidats ayant la possibilité d’interagir in vivo avec HOXA5 dans le système nerveux central. A l’exception de Twist1, l’ensemble des candidats présentent un patron d’expression chevauchant celui d’Hoxa5 dans au moins un des noyaux étudiés. Les méthodes de Co-Précipitation et de Bimolecular Fluorescence Complementation ont été utilisées pour confirmer les interactions entre HOXA5 et les différents candidats. Grâce à ces approches, nous avons pu confirmer la plupart de ces interactions à l’exception de celle entre PICK1 et HOXA5. La localisation cellulaire des interactions confirmées a été étudiée afin de mieux comprendre les fonctions potentielles de celles-ci. L’ensemble de ces interactions ont lieu dans le noyau ce qui concorde avec le rôle de facteur de transcription d’HOXA5 et de la plupart des interactants testés mais certaines ont également lieu dans le cytoplasme. Ces dernières interactions ouvrent la porte à des hypothèses innovantes sur les modes d’action et de régulation de la protéine HOXA5 ainsi que sur ses fonctions non-transcriptionnelles. L’ensemble de ces données supportent les fonctions transcriptionnelles d’HOXA5 en confirmant ses interactions avec plusieurs facteurs de transcription au sein du noyau. Cependant elles mettent aussi en évidence des interactions inédites comme celle entre HOXA5 et lui-même ou celle entre HOXA5 et IPO7Cter, qui permet d’identifier un acteur clé de la localisation cellulaire d’HOXA5 dans le noyau. The Hox genes encode very evolutionary-conserved transcription factors. They are mainly known for their roles during embryogenesis, especially in the establishment of the anteroposterior axis of the embryo. However, they are also expressed during postnatal and adult stages, including in the brain where 24 Hox genes are expressed after birth. Hoxa5 is one of those genes. The HOXA5 protein is produced in several pre-cerebellar nuclei of the pons and the medulla oblongata in the adult mouse brain following an expression pattern established during the late stages of embryonic development. Although this expression suggests that HOXA5 may have unknown roles in the brain after birth, its functions and modes of action remain to be determined. These are the questions that are being studied in Pr. Françoise Gofflot's laboratory, and one of the approaches used to tackle these issues is the study of the interactions of HOXA5. A list of interactors candidates of HOXA5 in the adult central nervous system was established based on the results of a yeast two hybrid experiment and the use of interactomic databases. During this master thesis, our objective was to validate the interactions of this list containing 10 interactors candidates belonging to different functional categories, in particular "Subcellular localization" (IPO7 full length but also IPO7Cter, a truncated protein without the N-terminal part of IPO7, and PICK1), “Transcription factors” (HOXA5, MEIS1, PBX1, PBX2, SMAD1, SOX2 and TWIST1), as well as an oxidoreductase (GLRX3). In situ hybridizations on mice brain sections at the post-natal stage and at the adult stage allowed us to select candidates expressed in the same cerebral nuclei as Hoxa5 in order to limit our study to the only candidates having the possibility to in vivo interact with HOXA5 in the brain. All candidates have an expression pattern overlapping the one of Hoxa5 in at least one of the studied nuclei, except Twist1. The Co-Precipitation and Bimolecular Fluorescence Complementation methods were used to confirm the interactions between HOXA5 and the different candidates. Thanks to these approaches, we were able to confirm most of these interactions except for the one between PICK1 and HOXA5. The cellular localization of the confirmed interactions has been studied in order to better understand the potential functions of these ones. Each of these interactions takes place in the nucleus, which agrees with the role of transcription factor of HOXA5 and of most of the tested interactors. However, some interactions also take place in the cytoplasm opening the door to innovative hypotheses on the mode of action and regulation of the HOXA5 protein as well as on its non-transcriptional functions. Those data support the transcriptional functions of HOXA5 by confirming its interactions with several transcription factors within the nucleus. However, they also highlight original interactions such as the one between HOXA5 and itself or the one between HOXA5 and IPO7Cter, which could be a key player in the localization of HOXA5 in the nucleus.