Validation fonctionnelle de mutations potentielles dans le récepteur tyrosine-kinase VEGFR3 comme causes de lymphœdème primaire.

Les lymphœdèmes primaires (PLE) regroupent un ensemble de pathologies chroniques d’origine génétique qui entrainent un dysfonctionnement du système lymphatique. On les observe chez des personnes porteuses de mutations au sein de gènes codant pour des protéines impliquées dans le développement du système lymphatique. Au laboratoire d’accueil, plus de 1000 patients-index souffrant de lymphœdèmes primaires sont étudiés ainsi que des membres de leurs familles afin de découvrir les gènes causaux et d’établir la co-ségrégation des mutations potentielles avec le phénotype de PLE ou de voir s’il s’agit de mutations de novo. Actuellement, environ 50 gènes ont été identifiés comme causes de lymphœdèmes primaires. Le premier gène à avoir été identifié (simultanément par le laboratoire d’accueil et une équipe américaine) code pour un récepteur tyrosine-kinase membranaire exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques, le VEGFR3. Le gène FLT4 codant pour ce récepteur est exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques et participe au développement du réseau lymphatique. Le but de ce mémoire est de valider l’impact des nombreux changements d’acides aminés trouvés dans VEGFR3 qui, pour la plupart, sont considérés comme des mutations uniquement par leur localisation dans la partie intracellulaire du récepteur, à l’instar des premières mutations publiées. Pour cela, des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées. Tout d’abord, une étape de mutagenèse a été effectuée afin de reproduire et amplifier les différents variants au sein d’un plasmide pcDNA3. Ensuite, nous avons transfecté cet ADN dans des cellules HEK293T pour surexprimer les variants de la protéine VEGFR3. Ceci nous a permis d’étudier par Western Blot le niveau d’expression et la stabilité des protéines mutées par rapport à la forme sauvage, ainsi que la phosphorylation d’effecteurs en aval. Des analyses par cytométrie en flux (FACS) ont également été réalisées afin de vérifier l’expression adéquate des variants du récepteur VEGFR3 à la surface des cellules.