Etude des interactions TLR4-PRDX5 et rôle de la protéine accessoire MD2

L’inflammation est un processus qui fait partie de l’immunité innée et est déclenchée lorsque certains types cellulaires, tels que les macrophages et les cellules dendritiques, reconnaissent des structures moléculaires présentes au sein des agents pathogènes, appelés pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Ces cellules peuvent aussi reconnaitre à leur surface des molécules endogènes produites ou libérées par les cellules stressées ou endommagées, appelées damage-associated molecular patterns (DAMPs) par le biais des pattern-recognition receptors (PRRs), tels que les toll-like receptors (TLRs). Les DAMPs libérées passivement ou sécrétées activement peuvent déclencher une réponse inflammatoire suite à une interaction entre ces molécules et les PRRs. Même si les peroxyrédoxines (PRDXs) ont été jusqu’à présent principalement étudiées pour leurs propriétés antioxydantes intracellulaires, de récentes études ont montré que certaines PRDXs libérées lors de lésions peuvent elles aussi jouer un rôle en tant que DAMPs et dès lors initier le processus inflammatoire. Ce travail de fin d’étude avait pour but de mettre en évidence les interactions spécifiques entre le récepteur TLR4 et la peroxyrédoxine-5 (PRDX5), et le rôle de la protéine accessoire MD2 dans un système in vitro acellulaire. Des études avaient déjà été réalisées concernant les interactions entre PRDX5 et TLR4 mais le rôle de la protéine accessoire MD2 dans ce contexte restait encore incertain. Dans un premier temps, l’objectif de ce travail était de produire dans E.coli les protéines recombinantes PRDX5, le domaine extracellulaire du récepteur TLR4 et la protéine accessoire MD2. Ces trois protéines recombinantes humaines devaient être purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne de Ni grâce à un tag 10xHis. Les différentes expériences réalisées au cours de ce travail ont permis de produire et purifier en grande quantité la PRDX5 recombinante. Les protéines TLR4 et MD2 ont été également produites dans E.coli mais en plus faible quantité et détectables par Western blotting. Dans un second temps, il s’agissait d’obtenir les protéines recombinantes dépourvues de leur tag 10xHis à l’aide d’un clivage par la protéase TEV. Différents essais de clivage réalisés sur la PRDX5 ont permis d’obtenir une protéine dépourvue de son tag 10xHis. Les clivages de la MD2 ainsi que TLR4 n’ont pas pu être réalisés en raison de la trop faible quantité de protéines recombinantes produites. Dans un troisième temps, en utilisant les différentes protéines recombinantes produites précédemment, nous avons réalisé des essais pull-down destinés à mettre en évidence les interactions PRDX5-TLR4 et PRDX5-MD2. Les faibles quantités de protéines TLR4 et MD2 recombinantes ont rendu l’interprétation des essais pull-down délicate. Les résultats obtenus avec les protéines PRDX5 et TLR4 se sont révélés trop variables pour être interprétés. Par contre, les résultats obtenus dans l’étude de l’interaction PRDX5-MD2 quant à eux suggèrent que ces deux protéines pourraient interagir. En conclusion, des optimisations restent encore à faire concernant la production des protéines TLR4 et MD2, ceci afin de réaliser des essais pull-down dans des conditions optimales. Cependant, nos résultats préliminaires en essais pull-down suggèrent que MD2 interagit avec PRDX5 et pourrait en effet jouer le rôle de protéine accessoire dans la reconnaissance de PRDX5 par le récepteur TLR4. Inflammation is a process that is part of innate immunity and is triggered when certain cell types, such as macrophages and dendritic cells, recognise molecular structures within pathogens, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). These cells can also recognise on their surface endogenous molecules produced or released by stressed or damaged cells, called damage-associated molecular patterns (DAMPs) through pattern-recognition receptors (PRRs), such as toll-like receptors (TLRs). Passively released or actively secreted DAMPs can trigger an inflammatory response following an interaction between these molecules and PRRs. Although peroxidoxins (PRDXs) have so far been mainly studied for their intracellular antioxidant properties, recent studies have shown that some PRDXs released during injury can also play a role as DAMPs and thus initiate the inflammatory process. The aim of this end-of-study work was to highlight the specific interactions between the TLR4 receptor and peroxyredoxin-5 (PRDX5), and the role of the accessory protein MD2 in an acellular in vitro system. Studies had already been carried out on the interactions between PRDX5 and TLR4 but the role of the accessory protein MD2 in this context was still uncertain. Initially, the aim of this work was to produce in E. coli the recombinant proteins PRDX5, the extracellular domain of the TLR4 receptor and the accessory protein MD2. These three human recombinant proteins were to be purified by affinity chromatography on a Ni column using a 10xHis tag. The various experiments carried out during this work made it possible to produce and purify the recombinant PRDX5 in large quantities. The TLR4 and MD2 proteins were also produced in E.coli but in smaller quantities and detectable by Western blotting. In a second step, the recombinant proteins without their 10xHis tag were obtained using cleavage by the TEV protease. Different cleavage tests carried out on PRDX5 made it possible to obtain a protein devoid of its 10xHis tag. The cleavages of MD2 and TLR4 could not be carried out because of the too low quantity of recombinant proteins produced. In a third step, using the different recombinant proteins produced previously, we carried out pull-down trials designed to highlight the PRDX5-TLR4 and PRDX5-MD2 interactions. The small quantities of recombinant TLR4 and MD2 proteins made the interpretation of the pull-down assays difficult. The results obtained with the PRDX5 and TLR4 proteins proved to be too variable to be interpreted. On the other hand, the results obtained in the PRDX5-MD2 interaction study suggest that these two proteins could interact. In conclusion, optimisations still need to be made concerning the production of TLR4 and MD2 proteins in order to carry out pull-down assays under optimal conditions. However, our preliminary results in pull-down trials suggest that MD2 interacts with PRDX5 and could indeed play the role of accessory protein in the recognition of PRDX5 by TLR4 receptor.